周围神经联合活化巨噬细胞移植修复小鼠脊髓损伤

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1、周围神经联合活化巨噬细胞移植修复小鼠脊髓损伤作者：刘洪智，周路纲，贺兰英，王磊，孙煜杰【摘要】目的］探讨周围神经联合活化巨噬细胞联合移植修复小鼠脊髓损伤（spinalcordinjury,SCI）的效果。［方法］首先获取活化巨噬细胞及周围神经备用，将所有实验用小鼠均制成脊髓半切模型，最后获得符合实验要求的小鼠共81只。将其随机分为4组，A组20只，为巨噬细胞移植组；B组20只，为周围神经移植组；C组21只为周围神经与巨噬细胞联合移植组；D组20只，为空白对照组。每一组内再随机分为3组，第1组7只，用来观察肢体运动恢复情况及神经电生理变化情况；第2

2、组7只小鼠，用来进行脊髓组织切片免疫组化检查；第3组6只小鼠（C3组7只），作为实验补充组。从术后第1周到术后第12周，通过术后BBB运动功能评分。SEP检测、免疫组化组织学观察来评估SCI的修复情况，采用SPSS12.0软件包用ONEWAY11ANOVA法进行数据处理，组间差异选用q检验进行两两比较，进行统计学处理。［结果］小鼠肢体运动功能评分及SEP检测结果：C1组与其他各组均存在差异（P＜0.01），动物肢体功能恢复显著。A1组和B1组与其他两组存在差异（P＜0.01），两组间相比，B1虽较A1组评分略高，但两者无统计学差异（P＞0.05）

3、。动物肢体功能恢复明显；免疫组化染色结果：C2组NF阳性细胞数目在SCI处的分布与其他三组有显著性差异。NF阳性细胞分布密度明显大于其他三组（P＜0.05）。［结论］周围神经与活化巨噬细胞联合移植能有效促进小鼠脊髓半切损伤的修复。【关键词】SCI；周围神经；活化巨噬细胞；SCI模型　　由于中枢神经系统微弱的再生能力，脊髓损伤（spinalcordinjury,SCI）后功能恢复困难是困扰临床医生和实验研究人员多年的课题。本研究应用周围神经与活化巨噬细胞联合移植修复小鼠SCI，通过运动功能评分、SEP检测、免疫组化染色组织切片观察等方法，观察其治疗

4、效果。　　1材料与方法　　1.1动物及试剂　　雄性BALB/C小鼠100只，体重25～30g，由山东大学医学院实验动物中心SPF级动物实验室提供。BALB/C小鼠为纯系传代繁殖，相互间细胞组织移植无排斥。主要试剂为AntiHumanCD68、AntiHumanGFAP、AntiHumanNF、免疫组化试剂盒（胰酶消化液，DAB显色剂，3%H2O2，福州迈新生物技术开发有限公司）。11　　1.2活化巨噬细胞的获得　　取1只雄性BALB/C小鼠，切取一段脊髓作为脊髓抗原。另取5只BALB/C小鼠，处死后向腹腔注射PBS获取小鼠巨噬细胞。脊髓抗原

5、和巨噬细胞一起培养获得活化巨噬细胞。然后进行细胞计数，调整细胞悬浮液浓度至105/ml。　　1.3周围神经的制备　　取BALB/C小鼠2只，游离并切除双侧坐骨神经备用。　　1.4小鼠脊髓半切模型的制备　　暴露BALB/C小鼠的T10椎棘突及椎板，在手术显微镜下仔细将其咬除显露脊髓，在硬脊膜背部中央血管左侧1mm处用细针头尖切割脊髓左侧半形成长约3mm的间隙。使左侧脊髓半切（图1）。　　图1脊髓半切模型制作过程（略）　　1.5最后获得符合实验要求的小鼠共81只11　　将其随机分为4组。A组20只小鼠，为巨噬细胞移植组；B组20只小鼠，为周围神经移植

6、组；C组21只小鼠，为周围神经与巨噬细胞联合移植组；D组20只小鼠，为空白对照组。每一组内再随机分为3组，第1组7只小鼠，用来观察肢体运动恢复情况及神经电生理变化情况。第2组7只小鼠，用来进行脊髓组织切片免疫组化检查。第3组6只小鼠（C3组7只），作为实验补充组。　　1.6周围神经及巨噬细胞的移植　　小鼠脊髓半切模型制备成功后，将坐骨神经制成长约3mm的神经段后填充于脊髓缺损处，术中应保持神经头尾端与脊髓一致且移植神经同脊髓断端紧密接触。用微量注射器取5μl活化巨噬细胞悬液，于手术显微镜下注入到脊髓半切的间隙内。　　1.7实验动物的神经学功能评估

7、及观察方法　　分别对A1、B1和C1组的7只小鼠，从术后第1周到术后第12周，进行每周1次的BBB肢体运动功能评分后，接着进行SEP（体感诱发电位）检查。分析所记录的SEP波形的潜伏期、峰间波幅。　　分别在小鼠行脊髓半切后的第1、4、711d、第2、4、5、12周分别随机抓取A2、B2、C2、D2组的1只小鼠进行病理标本制备及免疫组化染色。免疫组化染色用AntiHumanCD68标记活性巨噬细胞，用AntiHumanGFAP标记胶质细胞，用AntiHumanNF标记神经元轴突。按试剂盒说明书操作（福州迈新生物技术开发有限公司，二步法免疫组化

8、试剂盒）。　　1.8细胞及损伤区神经纤维计数　　用PBS代替一抗设立阴性对照，在损伤区利用血球计数板网格（每个网格为1μm2）连续计数1