周围神经联合活化巨噬细胞移植修复小鼠脊髓损伤

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1、周围神经联合活化巨噬细胞移植修复小鼠脊髓损伤作者：刘洪智，周路纲，贺兰英，王磊，孙煜杰【摘要】目的］探讨周围神经联合活化巨噬细胞联合移植修复小鼠脊髓损伤（spinalcordinjury,SCI）的效果。［方法］首先获取活化巨噬细胞及周围神经备用，将所有实验用小鼠均制成脊髓半切模型，最后获得符合实验要求的小鼠共81只。将其随机分为4组，A组20只，为巨噬细胞移植组；B组20只，为周围神经移植组；C组21只为周围神经与巨噬细胞联合移植组；D组20只，为空白对照组。每一组内再随机分为3组，第1组7只，用来观察肢体运动恢复情况及神经电生理变化情况；第2组7只小鼠，用来进行脊髓组织切片免疫组化检查；第

2、3组6只小鼠（C3组7只），作为实验补充组。从术后第1周到术后第12周，通过术后BBB运动功能评分。SEP检测、免疫组化组织学观察来评估SCI的修复情况，采用SPSS12.0软件包用ONEanCD68、AntiHumanGFAP、AntiHumanNF、免疫组化试剂盒（胰酶消化液，DAB显色剂，3%H2O2，福州迈新生物技术开发有限公司）。　　1.2活化巨噬细胞的获得　　取1只雄性BALB/C小鼠，切取一段脊髓作为脊髓抗原。另取5只BALB/C小鼠，处死后向腹腔注射PBS获取小鼠巨噬细胞。脊髓抗原和巨噬细胞一起培养获得活化巨噬细胞。然后进行细胞计数，调整细胞悬浮液浓度至105/ml。　　1

3、.3周围神经的制备　　取BALB/C小鼠2只，游离并切除双侧坐骨神经备用。　　1.4小鼠脊髓半切模型的制备　　暴露BALB/C小鼠的T10椎棘突及椎板，在手术显微镜下仔细将其咬除显露脊髓，在硬脊膜背部中央血管左侧1mm处用细针头尖切割脊髓左侧半形成长约3mm的间隙。使左侧脊髓半切（图1）。　　图1脊髓半切模型制作过程（略）　　1.5最后获得符合实验要求的小鼠共81只　　将其随机分为4组。A组20只小鼠，为巨噬细胞移植组；B组20只小鼠，为周围神经移植组；C组21只小鼠，为周围神经与巨噬细胞联合移植组；D组20只小鼠，为空白对照组。每一组内再随机分为3组，第1组7只小鼠，用来观察肢体运动恢复情况

4、及神经电生理变化情况。第2组7只小鼠，用来进行脊髓组织切片免疫组化检查。第3组6只小鼠（C3组7只），作为实验补充组。　　1.6周围神经及巨噬细胞的移植　　小鼠脊髓半切模型制备成功后，将坐骨神经制成长约3mm的神经段后填充于脊髓缺损处，术中应保持神经头尾端与脊髓一致且移植神经同脊髓断端紧密接触。用微量注射器取5μl活化巨噬细胞悬液，于手术显微镜下注入到脊髓半切的间隙内。　　1.7实验动物的神经学功能评估及观察方法　　分别对A1、B1和C1组的7只小鼠，从术后第1周到术后第12周，进行每周1次的BBB肢体运动功能评分后，接着进行SEP（体感诱发电位）检查。分析所记录的SEP波形的潜伏期、峰间波幅

5、。　　分别在小鼠行脊髓半切后的第1、4、7d、第2、4、5、12周分别随机抓取A2、B2、C2、D2组的1只小鼠进行病理标本制备及免疫组化染色。免疫组化染色用AntiHumanCD68标记活性巨噬细胞，用AntiHumanGFAP标记胶质细胞，用AntiHumanNF标记神经元轴突。按试剂盒说明书操作（福州迈新生物技术开发有限公司，二步法免疫组化试剂盒）。　　1.8细胞及损伤区神经纤维计数　　用PBS代替一抗设立阴性对照，在损伤区利用血球计数板网格（每个网格为1μm2）连续计数10个相邻区域巨噬细胞、星形胶质细胞或神经元轴突的数目并取其平均值。　　1.9统计学处理　　采用SPSS12.0

6、软件包进行ONEantovani等〔4〕认为，巨噬细胞受炎性反应中微环境不同的信号影响，可转变为“经典”活化型和“选择”活化型。“经典”活化型巨噬细胞可分泌前炎性细胞因子，对宿主细胞造成进一步的损伤。“选择”活化型巨噬细胞由IL4和糖皮质激素诱导转换而来，可调整免疫炎性反应的过程，清除坏死组织的残片，促进血管再生、组织重建和修复。本实验作者采用终细胞浓度为105/ml的巨噬细胞悬液5μl，脊髓半切伤后即时注入SCI处，明显减少了SCI后胶质瘢痕的形成，并促进脊髓断端的“出芽作用”，再生轴突可向远侧延长较远的距离。术后免疫组化染色观察见巨噬细胞移植组小鼠GFAP阳性细胞明显少于单纯脊髓半切组，

7、NF染色阳性细胞明显多于对照组。术后运动功能评分及SEP检测均有明显改善。这就证明了Bigini〔5〕巨噬细胞可促进神经轴突再生的观点。单纯脊髓半切组小鼠巨噬细胞数量在第4d开始上升，到第7d达到高峰。但却并没有起到促进轴突再生的作用。单纯神经移植组局部巨噬细胞数量明显较少，可能是周围神经含有雪旺氏细胞和神经营养因子，抑制了局部小胶质细胞/巨噬细胞的活性。但动物脊髓功能却有明显的改善。由此作者推断