免疫捕获pcr快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌

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1、免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌作者：周义正李向阳杨锦红【关键词】阳性　　金黄色葡萄球菌（S.aureus）是引发社区感染和院内感染的重要致病菌，其所致感染常以急性、化脓性为特征。以其引发菌血症而致的脓毒血症最为严重。作者采用免疫捕获PCR法（ImmunocapturedPCR，icPCR）检测S.aureus，即应用抗体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.aureus，再用PCR法快速检测ssa基因和mecA基因，以期建立一种快速准确地检测阳性血培养瓶中S.aureus的方法。　　1材料与方法　　1.1材料本实验所用的标准菌株均购

2、自卫生部临床检验中心，其它非标准菌株是本实验室保存的临床菌株，均分离自患者的血培养标本并得到Vitek-32全自动细菌鉴定仪的鉴定。引物：(1)ssa基因：ssa-F：5'-TCGGTACACGATATTCTTCAC-3'，ssa-R：5'-ACTCTCGTATGACCAGCTTC-3'［１］。(2)mecA基因：mecA-F：5'-GCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGC-3'mecA-R：5'-GATTGAAAGGATCTGTACTGGGT-3'。6　　1.2方法(1)抗体包被微量PCR管：人IgG以0.1mol/L的Na2CO3缓冲液（pH=9.

3、6）稀释至20μg/ml，取500μl加至0.6ml的PCR管中37℃孵育3h，再放置4℃过夜，然后倒掉包被液，加入500μl10%小牛血清在37℃孵育1h，最后以PBST洗3次，包被好的PCR管置4℃冰箱备用［２］。(2)免疫捕获和模板DNA制备：以无菌方式抽取阳性血培养瓶中的带血球菌液置无菌试管以2，000r/5min离心，取500μl上层菌液加入包被有人IgG的PCR管中在37℃孵育30min，然后倒掉菌液以PBST洗涤6次，每次2min，最后在吸水纸上扣干残液，以上完成免疫捕获，接着在捕获完后的PCR管中加入100μl双蒸水并在PCR仪上以99.9℃裂

4、解10min，然后参照《精编分子生物学实验指南》上的醋酸钠-异丙醇法［3］沉淀DNA并用70%乙醇洗涤，待自然干燥后加入10μl双蒸水即得到PCR反应所用的模板DNA。(3)PCR扩增反应体系和参数：反应体系包括10×Buffer5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，Taq酶1U，20μmol/L正反向引物各1μl，25mmol/LMgCl23μl，模板DNA10μl，最后补ddH2O至50μl。ssa基因和mecA基因的PCR扩增参数如下：先94℃预变性5min，再按94℃，30s→53℃，30s→72℃，1min，共35个循环；最后72℃6，10min

5、。目的基因片段大小分别为180bp和210bp。(4)最低检测限检测：先将在绵羊血琼脂平板上生长24h的S.aureus（菌株ATCC43300）纯菌落用无菌蒸馏水调置成1McFarland的菌液，然后以无菌操作方式将调好的1ml菌液加入血培养瓶中，再以无菌操作方式将5ml正常人无菌血加入同一血培养瓶中，最后将血培养瓶放入BacT/Alert全自动血培养仪直至阳性报警，接着以无菌操作方式从阳性血培养瓶中抽取5ml置无菌试管中2，000r/5min离心,再取上层菌液3ml作原始菌液并以新血培养瓶中的无菌培养液10倍系列稀释观察icPCR的最低检测限，每个稀释度做

6、5管，重复试验3次，原始菌液和各稀释菌液均以琼脂倾注法作活菌记数。(5)特异性试验：按照与最低检测限检测中相同的方法用表1中1-20号菌株制作模拟标本，分别用icPCR法检测ssa基因和mecA基因以鉴定S.aureus和MRSA，重复试验3次。(6)临床标本检测：以本实验室2006年7至8月收到的血培养标本中的106例阳性报警瓶为检测对象，分别采用传统方法和icPCR法进行检测S.aureus和MRSA。　　2结果　　以菌株ATCC43300为试验菌株的最低检测限检测显示，icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的ssa基因和mecA基因的检测限均在4

7、.3×104cfu/ml左右。icPCR法在10例由S.aureus模拟的阳性标本中检测到ssa基因，其中有6例还检测到mecA基因；其它10例非S.aureus模拟的阳性标本中均未检测到ssa基因和mecA基因。传统方法在106例阳性报警瓶中检测到9例S.aureus，其中3例S.aureus的苯唑西林MIC≥4μg/ml；icPCR法检测到的S.aureus与传统方法的结果相同，但在1例苯唑西林MIC仅为2μ6g/ml的S.aureus中也检测到mecA基因。若以传统方法为金标准，icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的灵敏度和特异度均达100%。

8、此外，用传统方法检测阳性报警瓶中S.a