噬菌体展示技术原理 噬菌体展示技术原理及应用

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1、噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术原理及应用17噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术原理及应用17噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术原理及应用17噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术原理及应用17噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术原理及应用17噬菌体展示技术的原理及应用张忠东，成　　　军，张树林张忠东，成军，中国人民解放军第３０２医院传染病研究所基因治疗研究中心，全军病毒性肝炎防治研究重点实验室　北京市　１０００３９张树林，西安交通大学第一医院传染科　　陕西省西安市　　７１００６１项目负责人：成军，１０００３９，北京市，中国人民解放军第３０２医院传染病研究所基因治疗研究中心．

2、　　ｃｊ＠ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ｃｏｍ．ｃｎ电话：０１０－６６９３３３９１　　　　传真：０１０－６３８０１２８３收稿日期：２００２－１０－２９　　　　接受日期：２００２－１１－１８张忠东，成军，张树林．　噬菌体展示技术的原理及应用．　世界华人消化杂志　　２００３；１１（４）：４５９－４６１http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/459.htm０　　　引言１９８５年Ｓｍｉｔｈ　［１］首次证实丝状噬菌体ｆｄ基因组能通过基因工程的手段进行改造，将ＥｃｏＲⅠ内切酶的部分基因片段（１７１　ｂｐ和１３２　ｂｐ）与ｐⅢ基因融合，获得的重组噬菌体

3、可在体外稳定增生，表达产物能被抗ＥｃｏＲⅠ内切酶抗体所识别．　１９８８年Ｐａｒｍｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ　［２］将已知抗原决定族与ｐⅢ的Ｎ端融合呈现在表面，可特异性地被抗体选择出来，并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想．　１９９０年ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ　　［３］也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法，从而开始了这项技术的广泛应用的新时代．１　　　噬菌体的基本特征噬菌体属于单链ＤＮＡ病毒，包括ｆ１、ｆｄ和Ｍ１３三类．噬菌体ＤＮＡ在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒．　噬菌体的单链

4、ＤＮＡ长约７　０００　ｂｐ，不同类型噬菌体其一级结构极为相似，基因组编码１１种蛋白质，其中５种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白ｐⅢ和ｐⅧ17．　噬菌体单链ＤＮＡ被包裹在大约２　７００－３　０００个主要衣壳蛋白ｐⅧ分子组成的管状结构中，另外次要衣壳蛋白ｐⅢ通过与大肠杆菌的Ｆ菌毛结合而引起感染，是噬菌体感染宿主所必需的．　ｐⅧ前体由７３个氨基酸残基组成，其中信号肽为２３个氨基酸残基，根据构成外壳的功能可分为四个区，６－２４氨基酸残基区域占据噬菌体表面的大部分，２５－３５氨基酸残基区域高度疏水性，Ｃ端（３５－５０氨基酸残基区域）与ＤＮＡ相结合，构

5、成完整的内壁，Ｎ端（１－５氨基酸残基区域）为可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置．　ｐⅢ前体由４２４个氨基酸残基组成，形成３－５个拷贝，位于噬菌体的尾部，他由四个功能区组成，信号肽区（１８个氨基酸残基）引导ｐⅢ至细菌胞间质，在ｐⅢ17分泌后被细菌蛋白酶水解，其后的穿膜区与噬菌体的侵入有关，受体结合区负责结合Ｆ菌毛，而Ｃ端的疏水区组装前黏附在细菌内膜上，组装后这段氨基酸序列锚在噬菌体外壳上，穿膜区是最外露的区域，因而成为插入外源基因的理想位置．２　　　噬菌体展示技术的基本原理噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，他以改构的噬

6、菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体．　其建立基于三个原因：（１）在ｐⅢ和ｐⅧ衣壳蛋白的Ｎ端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别；（２）利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗（ｐａｎｎｉｎｇ）方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；（３）外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链ＤＮＡ测

7、序推导出来．　该技术实现了基因型和表型的转换．噬菌体结构蛋白ｐⅢ和ｐⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质，在基因操作上，他们基本相同．　在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有单一的克隆位点便于插入，插入的外源多肽或蛋白质以融合的形式表达出来并分泌到胞间质内，当宿主蛋白酶切除信号肽后，融合蛋白组装成熟，呈现在病毒粒子的表面，新的Ｎ端位置正是外源蛋白或多肽的插入点．　与ｐⅢ基因融合时拷贝数低（不超过５个），这可以减少多价结合，利于选择高亲和力的配体分子，可容许插入大的片段．　与ｐⅧ17基因融合时，拷贝数高（２　７００个），当将属于多肽的表位用作免疫源时可产生良好的免疫应答

8、，具有反应优势，故在疫苗