15 噬菌体展示技术的原理.ppt

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1、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示的基本概念将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。直接将可见的表达型与其基因型联系在一起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。多年来,噬菌体展示技术被用于抗体的制备、多肽及蛋白质和酶的制备。特别是近几年来,该技术被作为一种新工具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质与蛋白质的相互作用及蛋白质与DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面的研究。一、噬菌体展示技术的原理LeadHvLinkLvPIIIPIII表达型融合蛋白PⅢ

2、菌毛蛋白3～5个拷贝PⅧ主要衣壳蛋白2700～3000个拷贝基因型噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。选择方法：淘选（Panning)而不是筛选（Screening)SolidphaseselectionwithimmunotubesBBBBBBvvImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBbiotinantigenSolutionphaseselectionwithbio

3、tinylatedantigenBindtoStreptavidincoatedmicrotitrewellsWashtoremoveunboundphageparticles.EluteboundphageAmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyzea)ELISAb)Specificityc)Sequencingd)Affinitye)ActivityE.coli感染和扩增固相淘选系统完整细胞组织，器官常规法淘选方法正负法竞争法噬菌体展示技术最关键的优势有三：第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二，所挑选到的噬菌体

4、可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。噬菌体（M13,T7,T4,)病毒（反转录病毒，杆状病毒）表面展示系统细菌（葡萄球菌，E.Coli)酵母体外共价连接（蛋白—DNA,蛋白—RNA)诊断被动免疫抗体蛋白质结构分析药物导航蛋白质纯化应用范围：受体—配体信息传递蛋白质—蛋白质诘抗剂蛋白质—DNA抑制剂蛋白质—其他多肽诊断基因表达控制中和活力药物及药物导航酶及底物噬菌体抗体库的构建AntibodyIgGstructureAntibodyIgGstructureCLVLVHCH1VLC

5、LVHCH1CH2CH2CH3CH3AntibodyIgGstructureVHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcMembraneExtensionAntibodyIgGstructureVHVLCLCH1CH2CH3AntibodyIgGstructureVHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable噬菌体展示ScFv抗体操作示例PCR产物的酶切（先平连再消化）载体的酶切库的连接反应电穿孔转化感受态E.ColiTG1细胞的制备抗体库的构建筛选检测分泌型ScFv的产生测序包括数轮识别-洗脱-复制

6、的过程活性克隆制备质粒DNA，VH和VL基因重新克隆于通用载体，利用通用引物测序。PCR直接测序电穿孔导入加入AMP抗性先构建轻链，再构建重链加入辅助噬菌体加入卡那霉素PEG-NaCl收集a)ELISA检测b)特异型检测c)序列测定d)亲和性测定e)活性测定单克隆抗体噬菌体抗体杂交瘤技术展示技术宿主细胞:杂交瘤细菌筛选范围:~103107109时间:几个月几周操作:繁杂相对简单免疫:必须可避免人源抗体:+费用:高低生产量:有限无限基因获取:再克隆直接应用前景:有限不可估二、噬菌体展示技术的应用现状抗体：抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV

7、-1感染并表达有gp120的淋巴细胞,中和响尾蛇毒素的单链抗，等等。疫苗：展示在噬菌体表面的HIV-1的gp120-V3环可象天然抗原一样引起显著的免疫应答,等等。3.多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13肽，它能中和蛇毒α-bungarotoxin；从CX7C多肽库中掏选到一个多肽能与Hantavirus结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿