基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测

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1、基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测作者：刘弋青，吕维敏，刘魁武△，陈仙明【摘要】细菌总数快速检测在质量监测中具有重要的意义，目前除了经典的平板培养法以外，还有微菌落法、阻抗法等快速检测方法，这些方法或者需要较长的检测时间，或者需要较高的检测成本。本研究提出一种不需要培养而在滤膜上直接计数的细菌总数的快速检测方法，它主要分为过滤、染色、显微镜计数和计算四个步骤。计算细菌总数时，根据细菌在滤膜上的分布特点，对传统公式进行改进，提出按区域计算细菌总数的计算方法，提高了检测精度。研究结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一种低成本、快

2、速的细菌总数检测方法。【关键词】细菌总数；检测；直接计数；滤膜；染色Abstract：Rapiddetectionoftotalbacterianumberisveryimportantinqualitycontrol.Now,therearemanyrapiddetectionmethodsoftotalbacterianumber,suchasmicroclonymethod,bioelectricalimpedancemethodandsoon,besidestheplatecountingmethod.Butthesemethodsneedmoretimeorhighercost.S

3、owepresentedanewmethod,observingdirectlyonthe8filterwithoutgermculture,itincludedfoursteps,filtration,coloration,observationandcalculation.Basedonthepointofdistributing,anewformulawasputforwardotherthanformerformula,soitimprovedthedetectionprecision.Theresultsrevealthattherearenosignificantdifferen

4、cesbetweenthenewmethodandtheplatecountingmethod(t=0.847,P=0.436＞0.05),anditisalowercostandfasterdetectionmethodoftotalbacterianumber.Keywords：Totalbacterianumber;Detection;Observingdirectly;Filter;Coloration1引言细菌总数计数的研究已有很多，目前国标规定的方法为平板计数法，该方法是将样品加入琼脂营养基，在37℃下培养24～48h后计数。这种方法精度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。为了简

5、化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了阻抗检测法［1］、SimplateTM全平器计数法［2］、微菌落技术［3-5］、纸片法［6-7］等检测方法，取得了一定的成果，但检测时间仍在4h以上。8本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法，具体步骤为：用集菌仪进行细菌收集→在膜上进行染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异，检测时间约1h，是一种快速的细菌总数检测方法。2材料与方法2.1材料本研究中用的试验材料有集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），染色剂，生物显微镜

6、（宁波永新光学股份有限公司），聚碳酸脂膜（直径47mm）。2.2实验方法2.2.1准备工作卸下集菌仪的滤网（见图1），统计滤网上小孔总数，为计算菌液浓度做准备。另外，还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌，以防止过滤过程中引入外源细菌。2.2.2细菌收集取一定浓度的霉菌菌液300～5008ml，装在集菌仪上，集菌仪采用蠕动加压方式对菌液施加一定的压力，使菌液流过孔径为0.45um的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌相对均匀地分布在滤膜上，而选用聚碳酸脂膜是因为这种膜具有良好的透光性，便于用显微镜观察。2.2.3染色集菌后取下滤膜，切下一部分放在载玻片上，进行染色、固定。染色的目的是增大细

7、菌与背景的对比度，便于观察。2.2.4显微镜计数与计算菌液经集菌仪过滤后，细菌在滤膜上的分布见图2、图3，由图可以看出细菌分布具有以下两个特点：一是细菌集中在一个个的圆形区域内，这些圆形区域和挡板的小孔相对应；二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分布的这种特点，提出以圆形区域为单位进行计数，统计出圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液中细菌总数。具体步骤如下：随机选择10个圆形区域，在油镜下，调节焦距