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1、人Qki5基因重组腺病毒的制备作者：白丽园,于芳,傅海燕,杨国栋,张杰,晋亮,卢兹凡【摘要】 目的:构建针对Qki5人重组腺病毒表达载体,并在能在转染该病毒的人乳腺癌细胞株MDAMB231中观察到该基因过表达效果。方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttleQki5IRESEGFP与骨架载体共转化到大肠杆菌BJ5183中,同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒。用获得的病毒感染Qki5表达较低的人乳腺癌细胞株MDAMB231,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RTPCR和Westernblot方法检测细胞中基因表达的变化。结果:
2、经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对Qki5基因的重组腺病毒载体构建成功。RTPCR和Westernblot方法证实,在MDAMB231细胞中,Qki5基因在mRNA和蛋白水平均有上升。结论:Qki5腺病毒载体够建成功并且可以在乳腺癌细胞MDAMB231内表达。【关键词】Qki5腺病毒乳腺癌 QKI作为一种RNA结合蛋白,可通过其KHdomain与目的mRNA的UTR的QRE结合,发挥调节mRNA的功能[1]。因此通过对靶基因功能的研究来推测QKI的功能是一种研究方法。生物信息学预测表明,在它的下游靶基因中有24%的基因参与免疫反应。例如,11趋化因子受体[chemo
3、kine(CCmotif)receptor4]就是我们所关注的分子之一。暗示QKI可能在免疫应答中发挥作用。腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达[2]。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是:而腺病毒除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此不会干扰其他的宿主基因。 为了更好的对QKI的功能进行研究,我们构建了腺病毒载体并在乳腺癌细胞中检测其表达情况。为今后对QKI5的研究提供一个工具。 1材料和方法 1.1材料含有基因Qki5的表达质粒pshuttleQki5IRESEGF
4、P。pAdeasy1腺病毒重组系统购自Stratgene公司;限制性内切酶KpnI,NotI和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;限制性内切酶PacI和PmeI购自NewEnglandBiolab公司;质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司;HDMEM培养基购自Hyclone公司;新生牛血清购自杭州四季青公司;LipofectAmineTM2000和TRIzolTM试剂购自Invitrogen公司,MLV购自Promega;兔抗人Qki5多克隆抗体、HEK293腺病毒包装细胞和人乳腺癌细胞MDAMB11231为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存。
5、 1.2方法 1.2.1pShuttleQki5IRESEGFP载体的构建KpnI,NotI双酶切Qki5的表达质粒pQki5IRESEGFP,将目的片段胶回收后亚克隆入经KpnI和NotI双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle、卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,双酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定。获得腺病毒穿梭质粒pShuttleQki5IRESEGFP。 1.2.2含有pAdEasyTM1载体电转化感受态的制备将BJ5183感受态细胞和电穿孔杯置于冰上,于40μL感受态细胞中加入1.0μLpAdEasyTM1载体（100g/L）,按电穿孔
6、供应商的使用说明转化BJ5183感受态细胞,BioRad仪器一般使用的参数为:200Ohms、25μF、2.5kV。用克隆重悬转化物。转入1.5mL离心管中,37℃震荡培养60min。将转化物铺3～5块LB/Amp（50mg/L）培养板,37℃培养24h。挑出3个克隆,提取质粒,以转化前的质粒做对照进行电泳鉴定。挑取正确的克隆至2mLLB培养基中,过夜培养后转接到200mL培养液中培养3h,收取细菌,蒸馏水洗涤2次后,用1mL无菌、预冷的100mL/L甘油轻轻重悬菌体,分装至无菌预冷的微量离心管中,每管20μL,保存于-70℃。11 1.2.3重组pAdEasyQKI5载体
7、的构建将用PmeI酶切线性化1μgpShuttleQki5IRESEGFP载体,乙醇沉淀回收后,电转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasyTM1的大肠杆菌BJ5183感受态细菌。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆,挑取较小的克隆扩增培养,提取质粒。用PacI酶切鉴定质粒,将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞,扩增阳性克隆并大量提取质粒,得到含Qki5IRESEGFP的重组腺病毒质粒。 1.2.4重组腺病毒的包装与病毒滴度测定用含100mL/L新
