人hcn4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

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1、人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾【关键词】腺病毒科ConstructionandidentificationofhumanH4generebinantadenovirus　　【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantadenovirusofhumanH4gene.METHODS:H4genefragmentidpAdTrackCMVtoformthetransfervectorbythemethodsofhomogeneousrebinationinbacteriaandthe

2、rebinantadenovirusine2000.Thetargetgeneerasechainreaction(PCR)andthetiteranditsinfectionrateinedusingthegreenfluorescentprotEin(GFP)expressionintheshuttleplasmid.RESULTS:RestrictionenzymedigestionanalysisandthesequenceanalysisconfirmedthattheH4geneicroscope.CONCLUSION:Therebinantadenovirus

3、containinghumanH4geneissuccessfullyconstructedbythemethodofhomogeneousrebinationinbacteria.　　【KeyRNA的80%［5］.最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在H4D553N或1613delC位点突变［6,7］.为了进一步深入研究H4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达H4的重组腺病毒载体.　　1材料和方法　　1．1材料　　腺病毒细菌内同源重组系统包括E.coliBj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒

4、骨架质粒pAdeasy1（美国JohnsHopkins大学Dr.HeTC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、RNaseA（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine2000（GibcoBRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（HispeedPlasmidMidiKit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）.其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.　　1．2方法　　1．2．1穿梭载体pAdTrackCMVH4的构建和鉴定　　1．2．1．1pAdTrackCMVH

5、4的构建质粒pcDNA3.1H4用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收4.7kb的H片段.穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收载体骨架，T4DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVH4.转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒.　　1．2．1．2pAdTrackCMVH4的酶切鉴定取0.5mL离心管，依次加入酶切缓冲液2μL，内切酶HindⅢ0.5μL，内切酶XbaⅠ0.5μL,重组质粒0.5μL，去离子水16.5μL，充分混匀，37℃水浴2h，酶切后10g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带.　　1．2．2细菌

6、内同源重组产生腺病毒质粒用100mL/L的冰冷的无菌甘油制备E.coliBJ5183及E.coliDH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVH4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物.分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500V,200Ω,25μF条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50mg/L）固体LB培养基筛选，16h后挑取10个克隆，提取质粒.PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdH4.重组腺病毒质粒pAdH4的序列测定：以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6PromterPrimer为

7、测序引物，采用ABIPRISMBDyeTM测序试剂盒在ABIPRISMTM377XLDNAsequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定.　　1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组病毒颗粒.转染前24h于每个T25cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50%～70%.转染当日，将4μgpAdH4质粒用PacⅠ酶切线性化，用20μLLipofectamine2000按说明转染293细胞，2d后荧光显微