实时荧光pcr检测乙肝病毒dna的临床意义

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1、实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义［摘要］目的：对实时荧光定量PCR测定的472例HBVDNA结果进行分析，以探讨其临床价值。方法：对472份临床血清标本用ELISA法进行定性检测，并依据乙肝两对半定性结果进行归类分组，再用实时荧光PCR定量检测。结果：92份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有89份HBVDNA为阳性，阳性率为96.7％，其PCR定量拷贝数为(3.23±1.45)×107／ml；168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有118份HBVDNA阳性，阳性率达到70.2％

2、，PCR定量拷贝数为(4.65±2.10)×105／ml；32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有11份HBVDNA为阳性，阳性率为34.4％，PCR定量拷贝数为(1.92±1.54)×104／ml；62份HBsAb(+)的标本HBVDNA阳性2例，阳性率为3.2％，PCR定量拷贝数为(5.45±1.14)×103；60份全阴性的标本HBVDNA阳性1例，阳性率为1.7％，PCR定量拷贝数为(2.36±1.12)×104／ml。结论：PCR定量测定HBVDNA可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况，更有利于临床治疗和疗

3、效观察。　　［关健词］实时荧光；PCR；乙肝DNA9　　乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10％。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。荧光PCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，而且整个实验过程均在完全封闭的状态下进行，不需要PCR的后处理和电泳检测，解决了PCR定量和防污染等问题，而且具有快速、准确、特异等优点。本文以472例血清

4、标本分别用ELISA法和实时荧光PCR法分别对乙肝标志物和HBV进行检测，报告如下。　　1　资料与方法　　1.1　血清标本来源　472份血清标本均取自2005年1月至2005年10月我院门诊及住院的患者。其中，男245例，女227例；平均年龄35.2岁。9　　1.2　血清标本的采集　采用灭菌的一次性带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血5ml，离心分离血清，-20℃冻存备用，集中检测。　　1.3　方法　　1.3.1　试剂　采用中山公司生产的乙肝两对半试剂盒，用ELISA法分别对472例血清进行HBV两对半进行检测并依据检测结果进行分组。分组如下：A：H

5、BsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)(大三阳)；B：HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)(小三阳)；C：HBsAg(+)、HBcAb(+)；D：HBsAb(+)；E：HBeAb(+)、HBcAb(+)；F：HBsAg(-)、HBsAb(-)、HBeAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)。　　1.3.2　荧光定量PCR检测HBVDNA含量　采用深圳匹基公司博日荧光定量PCR系统，按照试剂盒说明书操作程序对上述血清标本进行检测。9　　1.3.2.1　HBVDNA提取　血清100μl加DNA提取液1100μl

6、,13000r/min离心10min→弃上清→再加提取液Ⅱ25μl,振摇10s→100℃10min→13000r/min离心10min，上清液备用。　　1.3.2.2　扩增　取上清液2μl，加入盛有扩增反应液38μl(含引物，dNTPs，Taq酶及PCR缓冲液)的PCR反应管中，扩增40个循环，循环参数为37℃5min；95℃1min；60℃30s。　　1.3.2.3　使用博日实时荧光PCR定量DNA分析检测仪，并根据纯化HBVDNA建立的直线回归方程，直接作HBVDNA定量分析和数据读取，结果＜1.00×103copy／ml为阴性。　　2

7、　结果9　　实时荧光PCR检测结果，见表1。　　表1　实时荧光PCR检测结果（略）　　3　讨论　　血清HBV标志物(HBVM)的检测给临床诊断乙肝病毒感染提供了较便捷的诊断依据。在临床应用过程中发现由于病情的发展过程的结局的多样性，尤其是肝功正常而体内确实有病毒复制者的治疗中，定量PCR检测HBVDNA为HBV感染及其疗效的判定提供了一项重要指标。诊断乙型肝炎及了解病毒复制状态的检测指标主要包括两部分：病毒DNA的表达物及其抗体应答系统；病毒DNA。ELISA方法一直是临床诊断HBV感染的传统手段，它实际就是检测病毒DNA的表达物及应答系统［

8、1］，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，结果特异、准确。本研究对92份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有89份HBV9D