实时荧光定量pcr检测乙型肝炎病毒dna的研究

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1、实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研宄李亚萍(无锡市江阴利港医院超声科；江苏无锡214444)【摘要】探讨：乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA量之间的关系，分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用。HBVDNA定量是目前诊断乙型肝炎、判断病毒复制和评价患者肝脏病变、预后及药物疗效的重要指标之一，但在指导诊疗时仍需结合血清标记物、肝损害指标乃至HBV基因分型。方法：PCR核酸探针杂交法、RELISA、竞争定量PCR、实时荧光定量PCR,木文综述定量检测HBVDNA意义及PCR检测方法。结论：实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA是反映HBV复制水平的可靠指标，有助于疾

2、病的诊断及预后判断。【关键词】乙型肝炎病毒核糖核酸实时荧光定量PCR全世界超过20亿人感染过乙肝病毒，大约3.5亿人为乙型肝炎患者，每年约有100万人死于乙型肝炎病毒相关的肝硬化和肝癌。而我国更是全球乙型肝炎的高发国家之一，人群乙型肝炎病毒HbsAg的携带率高达10%。多年以来临床诊断HBV感染情况通常采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒血清标志物模型(HBV-M,俗称两对半｝，以了解和判断乙型肝炎病毒在体内的复制水平、传染性强弱等，对乙型肝炎的诊断、抗病毒疗效观察及预后判断均其有重要意义。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的，可以定量检测HBV-DNA，由于其灵敏、快

3、速、假阴、假阳性率极低，该技术已被广泛应用于临床检测，结合ELISA检测能够更为精确地了解HBV的感染情况。以下就对HBVDNA定量在诊断治疗上的定量原理和意义、定量方法作综述，探讨乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA数量之间的关系，分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用。1HBVDNA含量与血清标记物(HBVM)的关系1.1HBVDNA含量与HBeAg抗HBeHBeAg阳性是病毒复制活跃的标志，HBeAg阳性与检出HBVDNA的符合率接近100%，两者存在极强的相关性。一般认为若HBeAg阴性或抗HBe阳性，则提示HBV复制减弱，病情得到控制。但大量文献指出，HBeAg转阴

4、或抗HBe的出现并不说明病毒复制被控制，约50%抗HBe阳性的患者血清检出HBVDNA。单春梅等指出这可能是因为HBVDNA前C/C区基因变异，1896位G→A突变，原来TGG变成终止子(TAG),丧失HBeAg合成分泌功能，逃脱细胞毒T淋巴细胞(CTL)的免疫攻击。这种变异在我国乙肝患者中普遍存在，是导致病情迁延、发生慢性肝炎、甚至肝硬化重要原因之一。1.1HBVDNA含量与HBsAg/抗HBsHBsAg阳性代表机体感染HBV,不代表复制情况；HBsAb为中和抗体，标志着机体产生免疫力。HBsAg阴性不能排除HBV的感炎，Liang等报道36例HBVM均阴性的慢肝患者

5、，PCR检测奋11例(31%)HBVDNA阳性。范火亮从健康体检者抽取100份全阴标本，其中有2份PCR检测HBVDNA为阳性，说明ELISA检测HBVM全阴并不表示无HBVDNA复制。分析可能有几种原因：HBV的S区点突变导致HBsAg抗原性改变，HBsAg不被检出；急性感染的窗U期；HBsAg检测方法灵敏度不足；血清亚型的漏检等。1.3HBVDNA含量与HBV前S1蛋白(PreSl)、前S2蛋白(PreS2)、大蛋白(LP)的关系PreSl具冇高度的免疫原性，在HBV感染和机体免疫应答过程中起重要作用，PreSl在乙肝早期诊断中奋重要作用，能够反映HBV的复制情况，PreSl

6、阳性与HBVDNA阳性奋显著性相关，PreSl抗原与HBVDNA符合率为652%。PreS2冇较强的免疫原性，反映HBV复制的表型指标。乙型肝炎患者PreS2与HBeAg、HBVDNA呈伴随关系，PreS2的阳性率比HBVDNA高，PreS2抗原与HBVDNA符合率为764%。但PreS2不可替代HBVDNA。PreSl、PreS2反映HBV的复制活跃比HBeAg更敏感。1.4HBVDNA含量与肝功能有资料显示，血清HBVDNA的含量与肝功能指标均无相关性。张永红等指出HBVDNA和肝实质损害指标ALT、AST、PAB、ALB、TBIL、PT均不存在相关性，P>005,说明HBV

7、DNA载量并不反映肝功能受损的程度。HBV通过刺激宿主的免疫系统攻击受感染的肝细胞，间接引起肝损伤，HBV的肝细胞免疫病理损伤以T淋巴细胞毒反应为主，靶抗原的表达是决定靶细胞破坏的重要因素之一,肝细胞膜上表达的HBcAg、HBeAg、前S1蛋白和前S2蛋白是CTL攻击的主要靶抗原。2HBVDNA定量的临床意义HBVDNA是直接反应HBV复制状态及传染性的最佳指标，可用于判断乙肝感染的严重程度和传染性。HBVDNA的含量对观察抗病毒药物疗效、参考药物的剂量、用药吋间以及是否需要联合