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时间:2018-08-02
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1、单链抗体A7基因真核表达载体的构建【摘要】[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的真核表达载体,为单链抗体A7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的重组原核表达载体pHEN2单链抗体A7上扩增单链抗体A7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC9K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH5α后扩增,再用
2、AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和测定序列检查ScFvA7基因插入的准确性.[结果]构建pPIC9K-ScFvA7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFvA7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因的真核表达载体.【关键词】重症肌无力;抗体;真核表达载体ABSTRACT:OBJECTIVEToconstructarecombinanteukaryoicexpressionvectorofthesinglechainvariablefra
3、gment(ScFv)A7ofantibodyagainstthemainimmunogenicregion(MIR)ofacetylcholinereceptor(AChR)forthefurthereukaryoicexpressionandthegenetherapyinmyastheniagravis(MG).11METHODSTheScFvA7genewasamplifiedbyPCRfromtherecombinantprokaryoticexpressionvectorpHEN2-
4、ScFvA7,thenpurifiedanddigestedwithEcoRⅠandAvrⅡ.ThedigestedproductswereruninlowmeltingpointagarosegeleletrophoresisandpurifiedbyWizardPCRPrepsDNAPurificationSystem,thenligatedintoeukaryoticexpressionvectorpPIC9Kdigestedandpurifiedbythesamemethod.There
5、combinantvectorpPIC9K-ScFvA7wastransformedintoE.coliDH5αforamplificationandisolatedanddigestedwithAvrⅡandEcoRⅠagain.ThepPIC9K-ScFvA7genewasanalysedforaninsertoftherightsizebydigestionwithAvrⅡandEcoRⅠ.RESULTSThesequencingshowedthatthenucleotidesequenc
6、eofconstructedScFvA7wascorrectandclonedintotheopenreadingframe(ORF)inpPIC9K.CONCLUSIONTherecombinanteukaryoicexpressionvectorpPIC9K-ScFvA7hasbeensuccessfullyconstructed.Keywords:myastheniagravis;antibodies;eukaryoticexpressionvector重症肌无力是抗乙酰胆碱受体(acet
7、ylcholinereceptor,AchR)抗体介导的器官特异性自身免疫病,AchR是由α2βγδ11等5个同源亚单位组成的跨膜糖蛋白[1].现已发现,重症肌无力患者血清中2/3的抗AchR抗体针对的是α亚单位的主要免疫原区的第67~76位氨基酸表位[2].当致病性抗体与神经肌肉接头处突触后膜上相邻2个AchRα亚单位上的主要免疫原区结合后,通过抗原调变或激活补体作用使突触后膜损伤[3],AchR数量减少,结果出现受累肌肉收缩无力及麻痹症状[4].由抗AchR抗体制备的单链抗体(singlec
8、hainvariablefragment,ScFv)作为单价片段,只能与1个α亚单位上的主要免疫原区结合,不引起抗原调变作用,且单链抗体无可结晶片段(Fc),不能激活补体导致AchR损伤.但单链抗体与主要免疫原区结合后,可特异性地封闭抗AchR抗体的结合位点,从而对AchR起到保护作用.本实验将构建在原核表达载体pHEN2上的抗AchR主要免疫原区单链抗体A7(ScFvA7)基因克隆至真核表达载体pPIC9K上,构建了重组真核表达载体.1材料与方法1.1菌种与载体肠杆菌DH5α由荷兰马斯特里赫特
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