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1、人LTF基因真核表达载体构建【摘要】LTF基因表达产物乳铁蛋白为一种多功能糖蛋白，其具有调节免疫，抗炎、抗微生物、抗肿瘤等多种生物学功能。LTF在鼻咽癌中表达下调，但其在鼻咽癌中的功能尚未完全明确。为探讨LTF与鼻咽癌的关系，本研究以人cDNA为模板，PCR扩增LTF全长开放读码框，再将其定向插入真核表达载体，测序鉴定序列和插入方向正确。LTF真核表达载体成功构建，为进一步探索LTF基因在鼻咽癌细胞内的功能奠定基础。【关键词】真核表达载体；LTF；载体构建乳铁蛋白(Lactoferrin,LTF)是一种铁结合性糖蛋白，具有广泛的生物学活性。它不仅参与体内铁的转运及代谢、机体免疫调节，还具有抗炎
2、症、抗微生物及抗肿瘤等活性。鼻咽癌的发生是多因素、多阶段、多步骤的过程，遗传因素是其发生的重要因素之一。研究显示，LTF在慢性鼻咽炎中表达正常，在鼻咽癌中表达下调[1],提示LTF可能是鼻咽癌候选抑瘤基因。本实验构建了LTF基因真核表达载体为进一步进行LTF基因体内外功能研究奠定了基础。一、材料和方法(一)菌株和载体E.ColiDH5a菌株；pMD18-T载体(Takara)是一种高效克隆PCR产物(专用载体，有Ampr抗性；pcDNA3.1(-)载体(Invitrogen)含CMV启动子，具有Ampr和Neor抗性，在真核细胞中高效表达。(一)试剂高保真聚合酶(LATaq,Takara)；H
3、indllKXbal等内切酶、T4DNALigase(Fermentas)；质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒(Qiagen)；逆转录试剂盒(Promega)o(二)方法(1)引物设计和酶切位点分析(1)LTF基因ORF引物设计LTFmRNA序列(NM.002343.2),ORF扩增引物(目的片段2171bp),上游:5，-CGCCTCCAGACCGCAGACATGAAACTT-3，；下游：5，-CTGGGCCATCTTCTTCGGTTTTACTTC-3?。GAPDH引物(目的片段550bp),上游：5，-CCACCCATGGCAAATTCCTCCATGGCA-3'；下游：5，-TCTAGAC
4、GGCAGGTCAGGTCCACC-3，。(2)酶切位点分析Webcutter2.0分析LTF序列，结合pMD18-T和pcDNA3.1(-)载体特点,选用Hindlll和Xbal作为多克隆位点。(2)RT-PCR扩增LTF基因0RF慢性鼻咽炎组织总RNA抽提，两步法RT-PCR获得cDNAo(2)目的片段与克隆载体连接(l)PCR产物与pMD18-T载体连接：PCR纯化产物4uL,PMD18-T1nL,缓冲液5nL,补ddH20至50mL,16°C20ho(2)连接产物转化及鉴定：①质粒转化，菌落PCR鉴定。②质粒抽提和鉴定：挑阳性克隆培养，试剂盒抽提。③鉴定:a.HindHI/Xbal双酶
5、切。b.测序鉴定。(3)LTF真核表达载体的构建(1)目的片段插入真核表达载体：取质粒pMD18-T/LTF和pcDNA3.1(-),分别HindIII/XbaI双酶切，回收目的片段，体外连接，体系如下：10Xbuffer2pL,T4DNA连接酶1uL,LTF目的片段3uL,pcDNA3.1(-)线性片段luL,加ddH20至20uL,15°C18h,65°C10min。连接产物转化DH5q感受态。(2)阳性克隆鉴定：方法同前。二、实验结果(一)以cDNA为模板扩增LTF基因0RFRT-PCR方法从慢性鼻咽炎组织cDNA中克隆LTF基因ORFoPCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示片段大小正确
6、(约2・2kb)(图l)o图1RT-PCR扩增LTF0RF(0.8%琼脂糖凝胶)M：DL2000；Lane1-2：慢性鼻咽炎组织(GAPDH：550bp,LTFORF：2171bp）o（二）LTF基因ORFTA克隆载体的构建PCR扩增的LTF基因ORF产物进行TA连接、转化，挑Amp阳性克隆，PCR鉴定，第1-5号克隆可扩增出目的片段（图2A）。挑第5号克隆抽质粒，HindHI/Xbal双酶切，酶切产物电泳（图2B）o测序鉴定显示LTF基因ORF序列正确,并正向连接到PMD18-T载体。重组质粒命名为pMD18-T/LTFo图2LTF基因TA菌落克隆PCR和质粒Hindlll/Xbal双酶切鉴
7、定（0.8%琼脂糖凝胶）M：DL2000；图2ALane1-5为5个TA克隆菌落PCRCLTF：207bp）；图2B中Lane1-3为阳性TA克隆Hindlll/Xbal双酶切（2.6kb/2.2kb）o（三）LTF真核表达载体鉴定Hindlll/Xbal双酶切PMD18-T/LTF载体，回收LTF序列并体外连接到pcDNA3.1（-）上，转化、挑克隆，送菌液用T7通用引物测序（图3）。测序结果b
