幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因urei载体的构建、融合表达及纯化

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1、幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化作者：杨丽娟，姜政，向廷秀，陶小红，王丕龙【摘要】　　目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体，并在E.coliBL21中表达，为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以HpDNA染色体为模板，扩增HpUreI基因片段，将目的基因UreI与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切，纯化，连接。筛选阳性重组载体，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达pET32a(+)/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后，用SDS-PAGE及W

2、esternblot分析。结果经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为HpUreI编码基因，由585bp组成，与GenBank相应菌株HPAM417609序列完全一致，无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a(+)/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达，其重组融合蛋白分子量为130ku，经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后，其纯度达95%以上，Westernblot分析显示，该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别，具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a(+)/UreI，并在原核细胞中得到了高效融合表达。【关键词】幽门螺杆菌尿素通

3、道蛋白(UreI)原核表达14　　ABSTRACT:ObjectiveToconstructtheprokaryoticexpressionvectoroftheureachannelproteingene(UreI)ofHelicobacterpyloriandmakeitexpressedinE.coliBL21.MethodsThetargetgeneencodingUreIwasamplifiedfromHpDNAbyPCR,digestedbyrestrictedendonucleaseenzymeofHindⅢ,KpnⅠsimultaneously,andinser

4、tedintoprokaryoticexpressionvectorpET32a(+)digestedbycorrespondingrestrictedendonucleaseenzyme.Therecombinantplasmidwasusedtoselectandidentifybyrestrictedendonucleaseenzymedigestionandsequenceanalysisandtransform,meanwhileinduceittobeexpressedinE.coliBL21byIPTG.Therecombinationfusionproteinw

5、aspurifiedby6-HismarkedNi-TEDTMkitandanalysedbyWesternblot.ResultsRestrictionendonucleaseanalysisandsequencingshowedthatthetargetgenewasfoundtobe585basepairsandhadbeeninsertedintorecombinantvector.AscomparedwithgeneHPAM417609reportedbyGenBank,clonedUreIgenesequencewascompletelymatchedandcomp

6、osedof585bp.SDS-PAGEanalysisshowedthattherecombinantplasmidpET32a(+)/UreIcouldbeexpressedinE.coliBL21,itsrelativemoleculemassofexpressedproductwas130ku.AfterpurifiedwithNi-NTAagaroseresin,thepurityofrecombinantfusionproteinwasabout95%.Westernblotresultsshowedthattherecombinant14fusionprotein

7、couldbeidentifiedbyanti-6-Hismonoclonedantibody,suggestingthatthisfusionproteinhasgoodreactionogenicity.ConclusionThegenecodingforUreIisclonedandexpressedsuccessfully.　　KEYWORDS:Helicobacterpylori;ureachannelproteingene(UreI);prokaryoticexpression