凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究

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1、凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究【摘要】目的研究愈伤组织诱导过程中的褐变问题。方法：将采集的标本进行外植体灭菌法再接种到培养基，在培养基中加抗褐变剂，进行防褐变试验。结果外植体在4℃冰箱冷藏48h的预处理对褐变有较好的控制效果。在培养基中加入抗褐变剂比加入吸附剂抗褐变效果好，抗褐变剂中Vc的效果最佳，吸附剂PVP比活性炭好。结论培养条件，以低温遮光处理效果较好，光、温两个因素中，凹叶厚朴对光敏感，遮光能有效抑制褐变。液体浅层静置培养10d后转入固体培养抗褐变的效果比单纯的固体培养效果好。【关键词】1.凹叶厚朴（拉丁名：Magnoliaof

2、ficinalissubsp.biloba(Rehd.etWils.)ChengetLaw　　中文名：凹叶厚朴　　拉丁科名：Magnoliaceae　　中文科名：木兰科　　中文属名：木兰属　　海拔下限：400(米)　　海拔上限：1200(米)　　保护级别：国家Ⅱ级重点保护野生植物（国务院1999年8月4日批准）　　保护措施：产地有关部门亦应采取保护措施）；2.茎段；（愈伤组织中文名称：愈伤组织英文名称：callus;calli(复)定义：原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导

3、产生的无定形的组织团块。应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）；3.褐变控制；4.冷藏外植体；5.抗褐变剂；6.吸附剂：（吸附剂是能有效地从气体或液体中吸附其中某些成分的固体物质。吸附剂一般有以下特点：大的比表面、适宜的孔结构及表面结构；对吸附质有强烈的吸附能力；一般不与吸附质和介质发生化学反应;制造方便，容易再生；有良好的机械强度等。吸附剂可按孔径大小、颗粒形状、化学成分、表面极性等分类，如粗孔和细孔吸附剂，粉状、粒状、条状吸附剂，碳质和氧化物吸附剂，极性和非极性吸附剂等。）7.液体浅层静置培养凹叶厚朴Maganoli

4、abiloba（RehdetWils）cheng为木兰科植物，以干燥根皮及枝皮入药，有燥湿消痰、下气除满功效，用于治疗湿滞伤中、消化不良、呕吐泻痢、痰饮咳喘等病症。近年来，凹叶厚朴野生资源濒临枯竭，已被列为国家Ⅲ级保护植物。刘贤旺等[1]对凹叶厚朴进行了组织培养及愈伤组织超低温保存的研究，为凹叶厚朴的资源再生和种质保存提供了宝贵的技术资料和理论依据。在此基础上开展试验，发现在凹叶厚朴茎段组织培养过程中，褐化现象严重，需要多次转瓶才能诱导出愈伤组织。鉴于此，笔者专门针对凹叶厚朴茎段组织培养中出现的褐变现象进行了一系列比较试验，现报道如下。1材料与方

5、法1.1外植体及培养基4月底采自湖南省森林植物园，以嫩枝顶芽及稍下的茎段作外植体。愈伤组织的诱导采用刘贤旺的实验结果，即：B5+2，4-D2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8~6.0。每次处理10瓶，每瓶5个外植体，外植体大小约为0.6cm×0.6cm。1.2方法1.2.1外植体灭菌预处理后的材料用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗4次，吸干，在PVP1g/L溶液中切割，接种到培养基上。1.2.2防褐化试验分4个方面分别进行，即：外植体预处理、培养基中加入防褐变剂或吸附剂、培养条件、固体培养

6、和液体浅层静置培养后再固体培养。外植体预处理：用洗衣粉清洗，自来水冲洗1h，沥干后，保鲜膜密封置于4℃的冷藏箱分别冷藏24、48h，设对照为不冷藏。培养基中加抗褐变剂和吸附剂试验：培养基中加入Vc（10mg/L）、LH（1g/L）、巯基乙醇（1mL/L）、PVP（1g/L）、活性炭（2g/L）。培养条件试验：①低温遮光处理（20℃，遮光20d后，转入25℃及光下，光强1500LX）；②遮光处理（25℃，遮光20d，转入25℃及光下，光强1500LX）；③对照(25℃，每天光照10h，光强1500LX）。培养基：固体培养，在配好的培养基中加入6.5

7、g/L的琼脂；液体浅层静置培养，不加琼脂，瓶内培养基深度约为0.4cm，培养10d后，转入固体培养基中。计算方法：诱导率=（形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数）×100%。褐变率=（褐变的外植体块数/接种的外植体块数）×100%。2结果2.1外植体预处理对褐变的影响由表1可看出预冷处理有降低褐变的效果，使褐变率从对照的45%降低为30%~35%。冷藏时间48h比24h好。2.2培养基中加抗褐变剂和吸附剂对褐变的影响中国论文联盟www.LWLM.com编辑。表2结果看出，抗褐变剂和吸附剂能很明显的防止外植体的褐变，而且抗褐变剂的效果比吸附剂

8、好，前者褐变率为10.5%~18%，后者达到20.5%~25.5%。2.3培养条件对褐变的影响表3实验中，低温遮光处理与遮光处理的抑制褐