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1、第八节分子克隆载体的选择1.选择克隆载体的几个重要参数1）实验对象2）实验性质3）载体容量4）合适克隆位点5）载体的稳定性6）载体DNA制备的难易7）外源基因表达产物产量、产物特点等2.实验对象1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如
2、：E.coliDH5:F–,endA1,hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1,relA1,gyrA96E.coliDH5α:F–,endA1,hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1,relA1,gyrA96;φ80dlacZ△M15,△(lacZYA-argF)U169E.coliDH5αF’:F’,endA1,hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1,relA1,gyrA96,φ80dlacZ△M15,△(lacZYA-argF)U169i.三者均有限制-修饰系统
3、和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组ii.DH5α和DH5αF’都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景iii.DH5αF’可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在3.实验性质分子克隆的一般程序包括以下几步：i.分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNAⅱ.构建基因文库或cDNA文库ⅲ.目的基因或cDNA克隆的筛选ⅳ.目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等ⅴ.基因表达与调控机理的研究1)建立文库用载体常在E.coli进行i.目的基因与供体基因大小小—质粒载体，操作方便，鉴定简单大—λ或
4、cos质粒载体,甚至P1或pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用λ和cos载体）ii.筛选方法ⅰ)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性)ⅱ)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性ⅲ)杂交法：各种载体均可2)目的基因的鉴定次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体）3)基因表达与调控外源基因可表达—普通载体;不表达—表达型（分泌）载体4.载体容量M13mp载体<4kb细菌质粒载体<10kbλ载
5、体<23kbcos质粒载体<48kbP1载体<95kbpYAC载体∽1000kb5.合适的克隆位点单克隆位点和多克隆位点第九节分子克隆载体的组建构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点，标记基因，载体容量等。1.克隆位点的建立1)体外重组i.减少限制酶识别位点ii.增加限制酶识别位点：人工接头，匹配接头2)体内重组或突变i.减少限制酶识别位点体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系列载体时，去除Kanr基因中的HindIII位点就采用了以下技术路线：培养有pNG35的大肠杆菌细胞提取质粒DNA用HindIII完全酶切转化大肠杆菌再提取质粒DNA再酶
6、切，再转化，直至提取单菌落质粒DNA已无法用HindIII酶切为止ii.增加限制酶识别位点M13mp系列载体构建中EcoRI位点的建立体外诱变体内错配体外筛选α-肽链ThrMetIleThrAspSerM13mp正链5'…ATGACCATGATTACGGATTCACT…3'CH3互补链负链3'…TACTGGTACTAATGCTTAAGTGA…5'M13mp正链5'…ATGACCATGATTACGAATTCACT…3'α’-肽链ThrMetIleThrAsnSer2.标记基因的建立1）启动子2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围3）终止子3.载体容量尽可能除去无关
7、的DNA序列。第二章练习题1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位点后，重组质粒仍可转化E.coli(CmlsTcs)为CmlrTcr，为什么?可设计什么实验证明其假设?2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果?可设计何种实验证明你的解释是正确的?3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化E
