分子克隆载体

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1、分子克隆载体周俊宜fzyxzjy@126.com基因工程的表达体系操纵子理论在基因工程中的应用目的基因翻译表达及其准确性常用基因载体基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒基因工程的表达体系原核生物表达体系：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌大肠杆菌表达体系的优点：积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；操作安全，致病能力低；成本相对低得多；真核生物的基因

2、先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。缺点：原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；没有加工所需的酶系统；热源、内毒素不易除去；常会形成包涵体。表达体系的发展表达体载体宿主第一代原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌第二代酵母表达体系穿梭质粒酵母第三代哺乳类细胞表达体系病毒、脂质体培养细胞第四代基因直接导入DNA本身生殖细胞、体细胞、个体基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调

3、控。基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。操纵子理论在基因工程的应用一、启动子与转录调控原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。结构基因调控序列操纵子P：启动序列O：操纵序列I：调节序列IPOCAP调控区ZYX结构基因以乳糖操纵子（lacoperon）为例：诱导物ZYXIPOCAPZYXIPOCAP二、强启动子的构建开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowb

4、ox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点(recognitionsite)55RNA聚合酶保护区结构基因33RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列TAT

5、A盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件结构基因-GCGC---CAAT---TATA转录起始真核生物启动子保守序列RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合Ptac启动子Ptrp与Plac的杂化产物Ptac比原来各自的活性强-35区-10区PtrpTTGACATTAACT共有序列TTGACATATAATPtac17TTGACATATAAT乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶X-gal蓝色吲

6、哚产物三、蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）诱导物ZYXPOZYXPO乳糖标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ蓝色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶转录终止：非依赖ρ因子的转录终止需要茎环结构，以t（termination）代表。CGGCCGCGGCCUAAUGA5’…AUACCAUUUUUUUUU…3’四、转录终止结构的插入茎环结构使转录终止的机理使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复

7、合物趋于解离，RNA产物释放。5´pppG5335RNA-pol五、增强子转录起始前-30区为TATA盒，还有多种顺式作用组件相互配搭成启动子。增强子远距离地、不同方向地控制启动子的活性。增强子的核心序列是TGTGGAATTAG。增强子的作用特点有：非特异性远距离操纵、多方向性。酵母结构基因的上游还有上游活化序列（upstreamactivationsequence，UAS）。目的基因翻译表达及其准确性核糖体结合位点（S-D序列）mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D序列(Shine-Dalgar

8、no)，又称为核糖体结合点。3’…ACACUAGG…5’16sRNAUCU-C-C-U5’……AGGAPuPuUUUPuPu…AUGmRNAAGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTP基因克隆时的定向插入插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正