资源描述：
《酶组织化学应用课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、酶组织化学---水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法显示酶的组织化学方法1.金属沉淀法：磷酸酶的显示甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅硫化铅2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示酸性磷酸酶底物酶初级反应产物（PRP）重氮盐最终反应产物（FRP）水解酶---这是一类增加或去除水，催化水解反应的酶AB+H2OAH+BOH（一）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1）在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解最适PH9.2~9.4激活剂:如Mg++,Mn++,某些氨基酸等抑制剂:氰化物、砷酸盐等分布：广泛存在于机
2、体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘应用：1.肝脏病、白血病的研究诊断2.骨的发生和代谢疾病的研究中显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸钠磷酸酯+Ca++磷酸钙磷酸钴硫化钴【孵育液】2%巴比妥钠,3%β-甘油磷酸钠,2%无水氯化钙,5%硫酸镁【操作步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片2.不固定切片直接进作用液,或用1%氯化钙Formalin(Fca)固定5分钟~2小时,4℃,蒸馏水洗3.作用液10~60分钟,37℃4.蒸馏水洗5.2%硝酸钴1分钟6.蒸馏水洗AKP7
3、.1~2%硫化铵1分钟8.蒸馏水洗9.甘油明胶封片,或脱水,透明,中性树胶封片【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X100肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X2002.偶氮偶联法⑴Gomori萘酚磷酸酯法---AKP在碱性条件下将α-萘基磷酸钠水解出α-萘酚,随后α-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联,形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】α-萘基磷酸钠,蒸馏水,5%四硼酸钠,10%硫酸镁,固蓝B盐⑵六偶氮对品红与α-萘酚偶联---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红偶联【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO
4、),Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液,六偶氮对品红【操作步骤】1.小块组织液氮骤冷,低温冰箱切片2.甲醛钙液(Fca)固定5分钟,4℃,然后蒸馏水洗,也可不固定3.作用液5~60分钟,37℃或室温4.蒸馏水洗5.4%甲醛固定15分钟~2小时,室温6.自来水洗,蒸馏水洗7.1%甲基绿(氯仿洗过)5~10分钟,蒸馏水洗8.甘油明胶封片,或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色(二)酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP)在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解最适PH为4.8~5.2抑制剂因组织差异而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛分布:主要位于溶酶
5、体内应用:前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+++)Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+++)尤文氏瘤,成骨肉瘤等(-)显示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸铅法【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅硫化铅（黑色）【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色2.同时偶联法【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联,在酶活性处形成红色的不溶性复合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮对品红ACP【操作步骤】1.新鲜组织低温冰箱切片2.不固定或
6、吹干后丙酮固定15分钟3.用孵育液置于37℃水浴箱1~2小时4.流水洗,晾干(1~2分钟)5.用Mayer苏木精或1%甲基绿复染6.流水洗10分钟7.常规脱水透明,中性树胶封片【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色.胞核兰色(苏木精复染)或绿色(甲基绿复染)涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶X400(三)5′核苷酸酶(5′nucleotidase)催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5′位置水解磷酸酯的水解酶最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5,睾丸、脑、肝分别为8.5、7.5~8.5、8.0激活剂：Mg++，Mn++抑制剂：氟化钠（0.1MNaF），硼酸钠OHOHHOHOHHOHH碱基(嘌呤、嘧啶）（H）+
7、H2OPi5′NaseHO-CH2OHHOHHOH（H）H碱基CH2OPHO5′核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶5′核苷酸酶的显示----铅法【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷AMP磷酸+铅磷酸铅硫化铅（黑色）【注意】5′核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似5′NaseAKP1.肾组织中分布肾小管刷状缘(+),所有仅肾小管刷状缘(+)基膜也(+)2.β-甘油磷酸钠(—)(+)5′Nase作为底物(四
