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1、基因枪介导法转化苎麻获得转基因植株的研究作物杂志Crops2010.1基因枪介导法转化苎麻获得转基因植株的研究宫本贺熊和平马雄风喻春明王延周(中国农业科学院麻类研究所,农业部麻类遗传改良与工程微生物重点开放实验室,410205,湖南长沙;中国农业科学院棉花研究所,455000,河南安阳)摘要以苎麻品种中苎1号子叶愈伤组织为受体材料,利用基因枪法将外源双价抗虫基因(Cry-+吖)导入苎麻,以期建立基因枪转化苎麻的技术体系.结果表明,基因枪转化苎麻的最佳条件为轰击压力1300psi,金粉+DNA用量500~g+1.0枪,轰击距离9cm,轰击次数2次,共获得4株阳性转基
2、因植株.苎麻子叶愈伤组织的基因枪转化法是苎麻遗传转化的新方法,为建立苎麻基因枪转化体系奠定了基础.关键词苎麻;基因枪;子叶;愈伤组织苎麻(BoehmerianiveaL.)属荨麻科(Urticace.ae)苎麻属(Boehmeria)宿根性多年生草本植物,原产于我国,是优良的韧皮纤维作物,在世界素有"中国草"的美誉,是我国目前仅次于棉花的重要纺织纤维,也是重要植物蛋白饲料资源和新型生物质产业的基础材料.苎麻生长期间,鞘翅目和鳞翅目害虫多,造成的损失严重,喷施农药不仅会使害虫产生抗药性,而且会杀死天敌和污染环境¨.通过传统育种方法,苎麻产量有了很大的提高,但常规育种
3、在进一步提高产量,品质和抗性等方面的局限性已逐步显现,基因工程手段的逐步应用为苎麻育种提供了新途径.国内外相继有苎麻转基因研究成功的报道,这些研究大多利用农杆菌介导的方法将外源基因转入苎麻.基因枪转化法没有宿主范围限制,靶受体类型广泛,是继农杆菌介导法之后应用最广泛的一项遗传转化技术.目前,抗虫基因工程应用最多的是Bt杀虫晶体蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因,已获得的抗虫转基因作物有棉花,烟草,水稻,玉米,小麦,大豆,马铃薯,油菜等.本试验利用基因枪法对双价抗虫基因(CrylA+丌)导人苎麻作者简介:宫本贺,硕士研究生,研究方向为苎麻基因工程熊和平为通讯作者,博士生导师
4、,研究方向为苎麻遗传育种基金项目:国家"十一五"支撑计划项目(2006BADo6B03)和农业公益性行业科研专项经费项目(nyhyzx07—018)收稿日期:2009—09—24;修回日期:2009—10—22愈伤组织进行研究,对影响基因枪轰击转化的因素进行了探索,为建立有效,较为完善的苎麻基因枪转化体系提供理论依据,为最终培育出兼抗鞘翅目和鳞翅目害虫的苎麻种质材料奠定基础.1材料与方法1.1材料植物材料:供试苎麻品种为中苎1号,来源于国家种质长沙苎麻圃.表达载体:携带有双价抗虫基因(CrylA+")及报告基因的植物表达载体pGBI4ABC由中国农业科学院生物技术
5、所郭三堆研究员提供(图1).大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株为DH5a.图1pGBI4ABC表达载体结构图1.2质粒提取和PCR扩增参照质粒提取试剂盒(购自Tiangen公司)说明书进行.引物由上海生工合成,CrylA基因扩增引物为Btl5-CCTCTTCTAACTTGCCCTCCGC一3.Bt25.CACCCACGATG1TI'ACCGAGTG-3;T/基因扩增引物为Cptil5-GArrITGAAGCACCTCGGAAG-3,Cpti25.cTcATcATcrITrcATcccTGc.3.扩增反应体系如下:基因组DNA(1g/1)5primer(
6、20ng/tx1)3primer(20ng/Ix1)1l0.5Ixl0.5Ixl872010.1作物杂志CropsdNTP(10mMeach)10xTaqBufferTaq酶(5U/u1)MgC12Total0.5LLl2.5l0.4LLl2l25&1扩增条件:CrylA基因为95oC5rain,95℃1min,52oC1min,72oC1min,36个循环,72℃延伸10min;CpTI基因为95℃5rain,95qC1rain,53℃1rain,72oC1min,36个循环,72℃延伸10rain.1.3子叶愈伤组织培养与转化成熟子叶愈伤组织诱导培养基
7、为MS+0.25mg/L6一BA+0.12mg/LIAA+3%葡萄糖,愈伤组织分化培养基为MS+0.01mg/LTDZ+0.12mg/LIAA+0.12mg/LGA+3%葡萄糖,再生芽生根培养基为MS+0.46mg/LNAA+3%蔗糖.金粉的准备与DNA的包被参照Jiang等的方法.将培养1个月的疏松的子叶愈伤组织在含0.5mol/L甘露醇的MS培养基中进行高渗处理10～24h,用基因枪(Bio.Rad1000/He)进行轰击.轰击压力设置900psi,1100psi和1300psi,金粉及质粒DNA用量设置4个组合:1000~g+0.5g,1000~g+1.0g
8、,500~
