基因枪介导的转基因小麦的获得与鉴定

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1、基因枪介导的转基因小麦的获得与鉴定吴远志（华中农业大学生命科学技术学院，武汉４３００７０）摘要：运用基因工程技术将外源抗病基因直接导入具有优良农艺性状的小麦品种中，能够获得抗赤霉病小麦新品种。采用基因枪介导的共转化法，以ｂａｒ基因为筛选标记，将几丁质酶基因导入长江中下游小麦栽培品种郑麦９０２３，Ｔ０代经过ＰＣＲ鉴定，获得６株阳性植株，表明几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。.jyqkpa，距离９ｃｍ，真空度93.13kPa，轰击次数１次，每枪金粉用量为２５０μｇ，ＤＮＡ用量为１．５μｇ，根据Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司基因枪使用说明书提供的方法轰击，轰击后继续高渗暗处理１６ｈ。１．２．４恢复培养及筛

2、选轰击后的愈伤继续高渗１６～２０ｈ，然后转入恢复培养基于２７℃中培养，根据愈伤组织在恢复培养基上生长的状态，愈伤组织快速增殖开始出现大量胚状体的时候，即可转入分化筛选培养基。将恢复后的胚性愈伤组织转入分化筛选培养基，待愈伤分化出抗性绿芽后转入再生筛选培养基，将生长状态良好的绿苗转入生根筛选培养基。将生根筛选后存活的苗转入壮苗培养基中壮苗，随时观察苗的状态。当幼苗明显变绿，根系较发达时即可置于４℃春化，移栽至温室。１．２．５转基因植株的ＰＣＲ检测用ＣＴＡＢ法提取小麦幼嫩叶片基因组ＤＮＡ。对目的基因进行ＰＣＲ检测。以ｄｄＨ２Ｏ和未转化的同一品种植株ＤＮＡ作阴性对照进行ＰＣＲ扩增，可以扩增出４

3、０８ｂｐ的特异性片段。ＰＣＲ仪为ＭＪ－１００型，反应条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，６１℃退火４０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，１０℃１０ｍｉｎ终止反应。２结果与分析２．１小麦转ｂａｒ基因植株筛选取开花后１２～１４ｄ的麦穗，剥取麦穗中间部位比较饱满的体被白色绒毛呈嫩绿色的未成熟幼胚（图１Ａ），在无菌条件下剥取半透明状的幼胚，接种于愈伤诱导培养基中（图１Ｂ），挑选呈淡黄色，颗粒状，较致密的愈伤转至高渗培养基，置于小皿中央的圆圈内高渗处理４～６ｈ（图１Ｃ），轰击后的愈伤继续高渗１６～２０ｈ，然后转入恢复培养基于２７℃培养（图１Ｄ），恢复培养后愈伤组织

4、快速增殖出现大量胚状体（图１Ｅ），将恢复后的胚性愈伤组织转入分化筛选培养基分化筛选（图１Ｆ），分化筛选后愈伤分化出绿点（图１Ｇ），将长出的绿苗分成单株，转入生根筛选培养基筛选，得到部分抗性组培苗（图１Ｈ），将生根筛选后存活的苗转入壮苗培养基中，随时观察苗的状态。当幼苗明显变绿，根系较发达时即可置于４℃春化，移栽至温室（图１Ｉ）。２．２转基因植株的ＰＣＲ鉴定取郑麦９０２３Ｔ０代植株的幼嫩叶片，用ＣＴＡＢ法提取小麦叶片ＤＮＡ，用几丁质酶基因的特异引物ＬＩ／ＵＥＲ对抗性植株进行ＰＣＲ鉴定，郑麦９０２３在Ｔ０代获得６株阳性植株（表１，图２），表明几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。３小结与讨论几丁

5、质又称壳多糖，是由Ｎ－乙酰葡萄糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。广泛存在于自然界中，是真菌类细胞壁的主要成分。通过基因工程的手段将几丁质酶基因转入小麦中，使小麦获得分泌几丁质酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）的能力。当禾谷镰刀菌入侵小麦时，转基因小麦分泌的几丁质酶可将此真菌的细胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，从而达到抗病的效果。在本研究中，几丁质酶基因具有广谱抗菌功能，能抑制十几种病原菌和非病原真菌的生长及孢子萌发，其几丁质结合区对细胞壁的高亲和力导致其强烈的抑菌效果。Ｔ０代经ＰＣＲ鉴定，获得６株阳性植株，表明几丁质酶基因已经整合到小麦基因组中。ｂａｒ基因是从吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｈ

6、ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）中分离出来的，编码膦丝菌素乙酰转移酶（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｔｈｒｉｃｉｎａｃｅｔｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＰＡＴ），ＰＡＴ能够催化ＰＰＴ的游离氨基乙酰化，乙酰化的ＰＰＴ无法抑制ＧＳ活性，从而对ＰＰＴ起到解毒作用［１3］。含有ｂａｒ基因的植物具有对Ｂｉａｌａｐｈｏｓ的抗性，因此，ｂａｒ基因可作为选择性标记基因，利用其在转化植物体内中的表达，只要在筛选培养基中加入一定剂量的Ｂｉａｌａｐｈｏｓ，就会杀死非转化细胞，而生存下来的就是含有标记基因的转化细胞。在Ｂｉａｌａｐｈｏｓ筛选体系获得抗性植株１６４株，经ＰＣＲ鉴定，Ｔ０代才获得转基因小麦植株６株。这种在Ｂｉａｌａｐ

7、ｈｏｓ筛选体系下抗性苗多而阳性苗少的现象，可能是由于植物细胞本身具有一定的耐受性和抗逆性，非转化细胞即使在高浓度的筛选剂筛选中也出现逃逸现象，产生假转化体，还有可能是由于某些转化组织的解毒能力很强，能够使最接近的非转化组织得到交叉保护［１4］。..