细胞总rna提取及逆转录

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1、分子生物学实验1、每组同学做一份实验；2、遵守实验室规则，穿白衣；3、同学们在听课时要作好记录;4、上课时间。～欢迎大家参加分生实验课的学习！1.实验成绩考核占总成绩15%。2.每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。3.缺实验课成绩者，本课程不予通过。【每名同学的3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】2013年五年制实验课考试形式1.加样器2.离心机先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法3、根据取样量，选择合适量程的加样器。顶部标记加样器的最大量程，分别为：20l:0.5~20l100l:20~100l1

2、000l:200~1000l一、加样器的使用及注意事项1、用途——微量吸取液体2、每组3支加样器Q：如果要吸取5μl、50μl、150μl、500μl的液体，应选择哪个加样器?练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?4、如何调节？(1)首先观察目前的读数,假设为050:最大量程为20l的加样器—5l最大量程为100l的加样器—50l最大量程为1000l的加样器—500l(2)顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大(3)注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。

3、5、加样器使用步骤：1）选择加样器,观察读数,调节读数。安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。2）在液面外，先按到第一挡。3）将吸头插入液面下的适当深度:过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。4）缓慢松开拇指,吸取液体。完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！)7)观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。第一挡为实际读数体积，第二挡为帮助彻底

4、打出液体，避免吸头内液体残留。1、打开电源2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。3、将样品标记好并配平,对称放入离心机（管的连接处朝外）。4、设定离心的转速和时间。5、统一离心。TeamWork二、离心机的使用及注意事项实验一、细胞总RNA的提取及逆转录实验内容：1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳3、以总RNA为模板的逆转录反应一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴

5、结构20--200个A.翻译所必需。起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt第一步：提取小鼠肝脏组织的RNA二、RNA提取的注意事项RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃

6、器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。1)发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作1、异硫氰酸胍法：G

7、uSCN是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。课间介绍RNA提取的几种方法RNase抑制剂介绍1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%-

8、--0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材