菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

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1、实验一菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1.掌握用有机溶剂沉淀法从原料中提取分离目的蛋白酶的原理和方法。2.掌握用柱层析法纯化粗酶的原理和方法。3.掌握酶活力测定的方法。4.学习巯基蛋白酶的化学修饰及修饰酶与维修饰酶活力比较的方法。5.了解影响菠萝蛋白酶活性的因素，学习酶活力稳定性研究的方法。二、实验原理菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝果实、芽、茎中，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55。菠萝蛋白酶（E.C3.4.22.5）是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白酶、肽、脂和酰胺。菠萝萝蛋白酶广泛用于

2、食品领域、医药工业及化妆品等领域，有澄清啤酒、水解蛋白、烧伤脱痂、抗肿消炎等功效。1.低温有机溶剂提取菠萝蛋白酶本质为蛋白质，具有胶体的性质。蛋白质在水溶液中的溶解度是有蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度及蛋白质分子所带电荷的情况决定的。加入有机溶剂后，能使蛋白质表面失去水化层相互聚集而沉淀。在等电点时，加入有机溶剂更易使蛋白质沉淀。但是本法有时可引起蛋白质变性，因此用本法提取有生物活性的蛋白质时，应注意控制温度、有机溶剂浓度等容易引起变型的因素，并注意加入保护剂对酶进行保护。2.TiO2多孔陶瓷柱层析纯化二氧化钛(TiO2)粉末对菠萝蛋白酶有很好的吸附作用,用它作

3、为吸附剂纯化菠萝蛋白酶取得了良好的效果。TiO2对人体无害,在食品工业中使用具有很高的安全性;TiO2比较惰性,能耐受0.1mol/LNaOH和2mol/LHCl的处理,分离纯化可在较宽pH范围内进行。为了简化操作流程,将TiO2粉末用于柱层析,但TiO2颗粒太细,易产生堵塞。为了克服这一困难,将TiO2、陶瓷原料及发泡剂一起烧结,成为泡沫陶瓷,其结构和沸石相似,具有很大的表面积。陶瓷原料主要有3种:石英(SiO2)、长石(Ca-CO3)、粘土。粘土有很好的可塑性;石英能防止坯体在烧成时变形,并提高陶瓷的机械强度;CaCO3可降低制品的煅烧温度。活性炭作为发泡剂,高温下

4、完全燃烧成CO2挥发,形成多孔、质轻的泡沫陶瓷。本实验采用长石来烧制多孔陶瓷。已知，陶瓷孔度越大，吸附能力也越大。3.稳定性研究（本实验主要研究多元醇和糖类对其稳定性的影响）维系酶分子三维构象的作用力包括氢键、疏水相互作用、静电相互作用、范德华力,有些还包括共价二硫键,蛋白质分子无论是变性,还是增强稳定性,都是通过影响这些作用力来实现的。如钙离子在溶菌酶分子内部,通过和酶分子的羧基或羰基的静电作用,增强了酶分子各部分之间的紧密程度,因为在酶分子的疏水内环境中,静电作用是相对较强的。但总的来看,氢键、疏水相互作用在增强酶的稳定性方面起主要作用。当蛋白质受热变性时,分子中的

5、氢键结构发生变形,溶剂水分子作为氢键的受体或供体,去和蛋白质分子骨架及侧链上的基团竞争形成氢键,最终导致蛋白质分子结构的崩溃。研究发现,对菠萝蛋白酶起稳定作用的物质大多都有多个经基和梭基,能形成氢键,但它们形成氢键的能力比水小,对蛋白质分子氢键结构的破坏力也较小。疏水相互作用对维系蛋白质分子三维构象非常重要,在水和水溶性有机物组成的混合溶剂中,疏水相互作用的大小取决于溶剂的结构,当这个混合溶剂中的水分子最大程度形成氢键时,可获得最大的疏水相互作用。这样看来,多羟基和多羧基化合物对蛋白质分子稳定性的影响,就取决于这些物质对水分子结构的影响。Back等实验表明,疏水相互作用

6、在蔗糖或甘油溶液中比在纯水中强。但是,蔗糖或甘油又是如何影响水分子结构呢？Tait等提出了一种“专一水化模型”,他们认为如果多羟基化合物中-OH的取向使得它能和水分子形成氢键,它会在自己周围诱导形成一个由氢键连接起来的水化层,这样水分子的结构更有序,同时增强了非极性基团之间的疏水相互作用。1.活力测定菠萝蛋白酶是一种蛋白水解酶，可以水解蛋白酶、肽、脂和酰胺，采用酪蛋白为底物，水解产物为酪氨酸，又酪氨酸在275nm处又很强的紫外吸收，通过测定反应溶液的紫外吸收值即可在标准曲线上查到对应的赖氨酸浓度，进而可知道菠萝蛋白酶的水解活力。菠萝蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪

7、蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。1g固体酶粉(或1mL液体酶)，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。该方法所需试剂较少，操作手续较简便，但灵敏度较低。5.菠萝蛋白酶的化学修饰及修饰酶与未修饰酶活力的比较菠萝蛋白酶是典型的巯基酶，其巯基可以和很多试剂作用。它们很容易和烷基化或芳基化试剂反应。而作为蛋白质巯基常用的修饰剂有对氯汞苯甲酸（简称PCMB）、二硝基二硫基二苯甲酸（简称DTNB）、和N--乙基