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1、菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。2、学习酶活力测定的方法。3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。二、实验原理 菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。分子量为33000,等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，
2、不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清.还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白
3、酶。与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[pH7.0，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275nm)测定溶液中所含肽的数量。菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法[91]。每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M标×V/t×样品稀
4、释倍数/供测体积式中：(A-A0)为275nm波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw指以水为对照，275nm波长下50μg/mL标准酪氨酸光密度值；M标为标准酪氨酸溶液浓度；V为反应体系总体积（mL）；t为反应时间10min。4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。聚乙二醇(PEG)为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。三、实验材料
5、（一）试剂和材料1、新鲜菠萝(0.735kg)2、0.1mg/ml牛血清蛋白柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂、考马斯亮蓝、Brolain试剂、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液、50%甘油溶液（二）实验仪器榨汁机；离心机；紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；恒温水浴锅（37℃）；试管、试管架；烧杯、容量瓶；移液管；离子交换柱(250×10mm)；蠕动泵；自动部分收集器四、实验方法（
6、一）从菠萝中提取、纯化菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用经预处理的强酸型阳离子树脂和经组氨酸修饰后的强碱型阴离子树脂分别装入250mm×10mm的离子交换柱和离子交换层析柱，柱的长
7、径比为20∶1，将两柱串联。在常温下依次操作：加样：略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管量取菠萝蛋白酶粗品溶液，从交换柱顶部加入，使其沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。洗脱：加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表
8、面与柱口形成凸面，加入1MNaCl~20mMpH4.0醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）以1mL/min流速，开始洗脱部分收集：用自动部分收集器收集部分洗脱流出液。
