柠檬酸细菌内毒素检查方法论证

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1、柠檬酸细菌内毒素检查方法论证目的:建立柠檬酸细菌内毒素检查方法,应进行该产品细菌内毒素检查法的方法学论证。方法：采用光度法测定柠檬酸细菌内毒素,需进行标准曲线可靠性及供试品干扰试验。根据线性回归分析,对试验中标准曲线相关系数,内毒素回收率逐一验证。结果：根据方案随机抽取3批柠檬酸按规定方法试验,结果是标准曲线相关系数的绝对值大于或等于0.980，内毒素回收率在50%---200%。结论：本文建立的检查方法可用于柠檬酸细菌内毒素细菌内毒素检查及质量控制。1、试药细菌内毒素工作标准品批号：080206,效价为10eu,中国药品生物

2、制品检定所；细菌内毒素检查用水批号：080316,中国药品生物制品检定所；鲎试剂①批号：080119，灵敏度:0.06eu/ml，规格:0.5ml/支,广西北海市兴龙生物制品有限公司；鲎试剂②批号：080912，灵敏度:0.06eu/ml，规格:0.5ml/支,福州新北生化工业有限公司；2、标准曲线的可靠性试验2.1细菌内毒素标准溶液制备:取细菌内毒素工作标准品1支,加细菌内毒素检查用水1.0ml，密封；在涡旋混合器中混旋15分钟。再对上述溶液进行逐步稀释并制成1eu/ml0.5eu/ml0.25eu/ml0.125eu/ml

3、四中不同浓度细菌内毒素标准溶液。2.2鲎试剂的准备:分别取规格为0.5ml/支的鲎试剂①②,每支分别加细菌内毒素检查用水0.5ml溶解后并将同一批号的鲎试剂混合在一起,备用。2.3加样：取细菌内毒素专用试管并向每支试管中加鲎试剂0.1ml,再向每支试管中加细菌内毒素标准溶液（1eu/ml0.5eu/ml0.25eu/ml0.125eu/ml）0.2ml,且每个浓度细菌内毒素标准溶液做3个平行试管；轻轻混匀后,放入细菌内毒素测定仪中进行反应,并做阴性对照。2.4结果评价：通过检测结果可知,鲎试剂①:阴性对照反应时间大于标准曲线最

4、低浓度反应时间；标准曲线：lgt=2.85385-0.22801lgc；相关系数︱r︱=0.9834（＞0.980）；因此试验方法有效。鲎试剂②：阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间；标准曲线lgt=2.91534-0.19768lgc；相关系数︱r︱=0.9979（＞0.980）；因此试验方法有效。3、柠檬酸中细菌内毒素限度的规定每1mg中含细菌内毒素应小于0.5eu。4、柠檬酸中细菌内毒素最大有效稀释倍数的确定mvd=cl/λ=1.0mg/ml*0.5eu/mg/0.125eu/ml=4.05、干扰试验5.1细菌内

5、毒素标准溶液的制备,鲎试剂的准备5.2供试品溶液的制备:先称取供试品(批号:60247)100mg,再加入等量去热源碳酸钠,加入细菌内毒素检查用水10ml,混匀后，稀释成1mg/ml。根据供试品最大有效稀释倍数mvd=4.0,对供试品进行逐步稀释,并制成2倍、4倍供试品稀释液及2倍、4倍供试品阳性稀释液。5.3加样：取细菌内毒素专用试管并向每支试管中加鲎试剂0.1ml,再向每支试管中加细菌内毒素标准溶液（1eu/ml0.5eu/ml0.25eu/ml0.125eu/ml）0.2ml及各个浓度供试品稀释液及供试品阳性稀释液,且每

6、个浓度内毒素标准溶液做3个平行试管;轻轻混匀,放入细菌内毒素测定仪中进行反应,并做阴性对照。5.4结果评价：通过检测结果可知,鲎试剂①:阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间;标准曲线：lgt=2.83383-0.23688lgc;相关系数︱r︱=0.9996（＞0.980）；因此试验方法有效。当稀释倍数为4倍时,干扰最小,因此在以后检测中采用4倍供试品稀释液对供试品进行检测。鲎试剂②:阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间；标准曲线lgt=2.93051-0.18781lgc；相关系数︱r︱=0.9996（＞0.

7、980）；因此试验方法有效。当稀释倍数为4倍时,干扰最小,因此在以后的检测中采用4倍供试品稀释液对供试品进行检测。6、供试品的检测6.1细菌内毒素标准溶液的制备，鲎试剂的准备:6.2供试品溶液的制备及稀释：供试品溶液的制备操作同5.1,根据干扰试验结果,对供试品（60247,60249,60252）进行逐步稀释,并制成4倍的供试品稀释液及4倍的供试品阳性稀释液。6.3加样：取细菌内毒素专用试管并向每支试管中加鲎试剂0.1ml，再向每支试管加细菌内毒素标准溶（1eu/ml0.5eu/ml0.25eu/ml0.125eu/ml）及

8、各个批号供试品稀释液及供试品阳性稀释液0.2ml,且每个浓度的细菌内毒素标准溶液做2个平行试管；轻轻混匀,放入细菌内毒素测定仪中进行反应,并做阴性对照。