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1、人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建论文葛红岩于旭辉尚巍赵秀梅张璐高维奇刘平【摘要】目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体。方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区，将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中，进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了人TGFBI的编码基因，并成功建了其真核表达载体。结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定。【关键词
2、】TGFBI角膜营养不良真核表达CloningofhumanTGFBIgeneanditseukaryoticexpressionplasmidconstructionAbstractAIM:ToclonehumanTGFBIgeneandconstructitseukaryoticexpressionplasmid.METHODS:ThefullcodingdomainsequenceofTGFBIgenehumancornealtissuefromoperativespacemanerasecha
3、inreaction(RT-PCR)andent,digestedeXbaIandSalI,idpCI.Thenthereconstructedplasmidedigestionandsequencing.RESULTS:HumanTGFBIgeneplifiedanditseukaryoticexpressionplasmididcontaininghumanTGFBIgeneestablishedthefoundationofstudyingofthemechanismsofTGFBIgenemu
4、tationrelatedcornealdystrophy.·KEY_000358）,利用软件Oligoprimer5辅助设计克隆TGFBI基因的上、下游引物，由上海英俊生物有限公司合成。上游引物hTGFBIF：5′TATATGTAGAGCCAGCATGGCGCTCTTC-GTGCG３′,下游引物HtgfbiR：５′GTGCGTCGACCGTAA-TGCTTCATCCTCTC３′。上游引物Ｆ的５′端设有酶切位点，下游引物R的５′端设有SalI酶切位点。PCR产物为2089bp。取人角膜缘组织300mg
5、,加入Trizol试剂3mL,匀浆器匀浆。转入DEPC7mL处理过的EP管,.freelin后,4℃，12000ｇ,离心10min。加入氯仿0.6mL,用力混匀，室温放置3min后,4℃,12000ｇ,离心15min。取上清，加入异丙醇1.5mL，室温放置10min后,4℃，12000ｇ,离心10min。弃上清，加750g/L乙醇3mL，振荡混匀,4℃,9000ｇ，离心5min。弃上清，空气干燥后，加入DEPC20μL处理水溶解。根据Takara两步法RT-PCR试剂说明，建立反转录体系40μL。向上
6、步总RNA20μL中，加入oligo.dT5μL,70℃水浴5min后，立即放在冰上2～3min。继续加入RNA酶抑制剂1μL，5×RTBuffer8μL，25mmol/LdNTP4μL，0.1mol/LDTT4uL，200kU/LM-MLV1μL，混匀，37℃水浴3～4h。以反转录产物为模板，建立克隆TGFBI基因PCR反应体系，反应体系为50μL。其中模板1μL，25mmol/LdNTP4μL，上、下游引物各2μL，5kU/LExTag酶0.3μL，10×ExTagBuffer5μL。反应条件为预
7、变性为95℃5min,94℃60s,52℃60s,72℃90s,35个循环,72℃延伸10min。1.2.1pMD18-T/TGFBI亚克隆的构建扩增产物电泳,进行回收,按产品说明书操作。回收产物与pMD18-T载16℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苄青霉素、IPTG和X-GalLB平板，分别挑取蓝白斑,提取质粒用限制性内切酶和SalI进行双酶切鉴定，得到pMD18-T与TGFBI重组载体。1.2.2pCI/TGFBI真核表达载体的构建重组的pMD18-T/TGFBI与载体pCI质
8、粒用限制性内切酶和SalI双切割,胶回收后通过T4连接酶进行连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,提取质粒分别用双酶切和基因测序鉴定所筛选的阳性克隆。2结果以人角膜组织基因组中RNA为模板进行两步法RT-PCR扩增TGFBI基因,将产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，在2.1kb处可见条清晰明亮的目的条带，片断大小与GeneBank中公布的片断大小相等，而阴性对照无目的条带出现(图1)。2.1重组质粒酶切鉴定挑选pMD1
