sds-page和western blotting实验设计

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1、SDS-PAGE和Westernblotting法测脊髓细胞内Caspase-3【前言】1.关于SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳）：⑴发展历程：SDS-PAGE技术，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，最初由Shapiro于1967年建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善，他们在凝胶系统和样品液中加入十二烷基磺酸钠（SDS）以后，对经过处理的蛋白质组分能够更好地分离。1970年，Laemmli首次使用了三羟甲基氨基甲烷（Tris）—甘氨酸缓

2、冲体系，并对SDS-PAGE方法进行了改进，这一缓冲系统以后被普遍采用。此后，Fling和Gregerso在Laemmli方法的基础上进一步改进，在电泳后增加了凝胶固定这一步骤，可固定一些低分子量的蛋白质，并将样品中蛋白的电泳结果与标准蛋白电泳结果进行比较，可对被分离的蛋白质依据分子量进行定性分析，并可根据谱带的强度，借助光密度仪进行定量分析。⑵基本原理：SDS-PAGE技术中，SDS是一种阴离子去污剂，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS

3、溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物（一种形似“雪茄烟”的长椭圆棒，其短轴长度相等），这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异和结构差异，由于SDS与蛋白质的结合是和蛋白的分子量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）

4、作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶。SDS-PAGE以此为支持物进行电泳，一般采用的是不连续缓冲系统，不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。该体系2种孔径的凝胶（浓缩胶、分离胶）、2种缓冲体系（Tris-Hcl、Tris-甘氨酸）、3种pH值（电泳缓冲液pH=8.3,浓缩胶pH=6.8，分离胶pH=8.9）形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩与分离的主要因素。样品进入浓缩胶（孔径较大），由于氯离子和少量甘氨酸根离子形成的高电场作用，蛋白被浓缩至一个狭窄的区带。进入分离胶（孔径较小），由于聚丙烯酰

5、胺的分子筛作用，小分子的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质受到较大的阻力而滞后，这样蛋白质在电泳过程中就被分离。2.关于Westernblotting（蛋白质印迹法）：它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗

6、体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。SDS-PAGE与Westernblotting方法结合，可用来确定蛋白分子量大小，检测不同蛋白分子的相对含量，也广泛应用于检测蛋白水平的表达，检测蛋白纯度等。3.关于Caspase-3：Caspase-3是Caspase家族的一员,是哺乳动物细胞凋亡的关键酶。Caspases家族是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中、结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋

7、亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。其最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。【实验目的】掌握SDS-PAGE和Westernblotting法的原理，熟悉实验操作步骤、用途及结果分析，了解实验动物组织的处理及细胞凋亡蛋白Caspase家族。【材料与方法】1.1材料：

8、TOCP染毒母鸡和正常母鸡脊髓组织；TritonX-100，Tris，盐酸,氯化钾，氯化镁，氯化钠，EGTA，DTT，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂；一抗兔抗鼠caspase-3多克隆抗体、二抗羊