人精子扫描电镜样品的制备与观察.doc

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1、人精子扫描电镜样品的制备与观察作者：孔祥林,刘鲜林,常傲霜【关键词】精子；显微镜检查，电子，扫描；超微结构　　扫描电镜在临床医学、基础医学等领域具有广泛的应用价值，尤其在白血病、红细胞病变、细胞凋亡等游离细胞的临床诊断及基础研究方面得到了广泛的应用［1］。随着计划生育和优生优育工作的开展，对人精子的超微结构研究受到了广泛重视。由于人精子含水量大，表面导电性差，因此是扫描电镜样品制备和观察的难点。为了使其适应扫描电镜观察的要求，并更好地显露其表面的形态结构，在制样过程中需要对其进行清洗、脱水。由于水的表面张力为72.75dyn/cm，样品极易受到脱水张力的损伤，发生收缩和变

2、形［2］。同时在扫描电镜下观察时，由于其二次电子的产率低，样品密度低，电子束容易穿透；而样品脆弱，又经不起电子束长时间的照射。因此，要想取得质量较好的图像，正确调整扫描电镜工作时的参数也非常重要。我们通过反复对不孕症患者精液样品的制备和观察，总结出一套较好的制样方法，并选择适合的加速电压，取得质量较好的图像。　　1材料和方法　　1.1仪器　　　　漩涡混合器，普通离心机，普通冰箱，JEMJEE-5B真空冷冻干燥机，HITCHE-1010离子溅射仪，HITCHIS-3400N扫描电镜。　　1.2样品制备　　　　24h内（4℃冷藏）送样（10ml试管）的精液，漩涡混合器摇匀（1

3、～2min）。采用离心清洗法：用吸管吸取样品1ml，加5mlPBS（或生理盐水）离心清洗（2500～3000r/min，5min）3次，注意：去上清液时宜缓慢倒出，每次管底留液应不少于0.5ml［3］。加3%～4%戌二醛固定30min，PBS离心清洗2次，清洗方法同前。然后分别用50%、70%、90%、100%乙醇作梯度脱水，每次15min，离心3000r/min，5min。在常温、常压下（也可在冷冻条件下）用100%的醋酸异戌酯置换乙醇，时间30min,然后3000r/min，离心5min，去除上清液（可见管底有白色絮状物），用吸管吸管底液2～3滴滴到载璃片上，自然干燥

4、（也可采用JEE-5B真空冷冻干燥机干燥），用玻璃刀切下含有样品的部位，大小2cm×2cm。粘样后进行表面导电处理：HITCHE-1010离子溅射仪喷金，时间80s，电流15mA，真空7～10Pa。　　1.3精液样品的观察　　　　电镜参数设置：图像模式为SE，束流（Emission）70nA，工作距（WD）20mm/30mm，样品台倾斜（T）400，物镜光栏（AP）2～3号，亮度对比度为自动，3焦距为自动加手动，物镜消像散（OS）为手动。扫描电镜观察设两组不同的加速电压-放大倍率条件，第1组：10kV、20kV、30kV×10000倍；第2组：12kV×10000倍、×1

5、5000倍、×20000倍。　　2结果　　10kV加速电压的图像质量较好，图像显得比较自然，背景噪音较小（图1）。20kV加速电压的图像显得生硬，表面粗糙，样品及背景有雪花点噪音，样品边缘出现变亮的放电现象（图2）；30kV图像焦距不清，无法通过调焦得到理想的图像（图3）。第2组观察条件中，12kV×10000倍×15000倍图像较好（图4、图5）。12kV×20000倍以后，聚焦开始变差，样品表面已感模糊，样品表面可观察的细节，并没有随图像的放大而有更多的细节显露（图6）。　　3讨论　　　　精液样品制作与液体细胞培养、血液、组织渗图110kV加速电压的图像（10000倍

6、）出液、感染脓液、咯血、呕血、痰液、脑脊液、胸腹水等类似，必须先清洗后固定。因为清洗掉样品表面的杂物，有利于充分显露样品表面的细节和减少观察时的干扰。乙醇的表面张力为22dyn/cm，对生物样品的损伤较小是比较合适的固定剂［2］。采用乙醇梯度脱水再用醋酸异戌酯置换乙醇，是本样品处理方法的关键。在清洗和固定过程中，离心是主要的分离手段，其中把握好离心速度和离心时间十分重要。因为，离心力过大样品中该清除的粘液、杂质会沉入管底，达不到清洗的目的；离心力过小去除上清液时样品会丢失过多，给电镜观察带来困难。经多次实验观察，2500～3000r/min离心5min较适合该样品的清洗。

7、　　　　电镜观察中，锁定了束流和工作距离等可以调整的参数，以加速电压和放大倍率作为观察条件指标，设置了：10kV、20kV、30kV×10000倍；12kV×10000倍、×15000倍、×20000倍两组观察方法。观察发现，按上述方法制成的样品，扫描电镜的图像质量较好，样品表面比较干净，轮廓显露完整、形貌清晰，损伤、变形较小，表面有细节可见。经倾斜样品台400观察，图像立体感强，样品的相互关系清晰易于判断。　　由于二次电子主要是来自样品10nm的浅层，反映样品的表面形貌衬度［4］。25kV、30kV加速电压过高，入射电子束进