激光共聚焦显微镜技术

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1、激光共聚焦显微镜技术吉林大学人兽共患病研究所王心蕊绪论激光共聚焦显微镜技术（ConfocalLasersScanningMiccruscopeCLSM)CLSM是将显微镜技术与激光技术有效的结合，使用紫外或可见光激发荧光探针，对有荧光标记物的形态及功能，利用计算机进行成像，从而得到细胞或内部微细结构的荧光图像。它汇集了激光技术，显微镜技术，免疫荧光技术，计算机及图像处理技术，精密的机械技术等高，精，尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。激光共聚焦显微镜发展史在1957年MarvinMinsky提出共聚焦显微镜的理论，但共聚焦显微镜作为商品推出是在20世纪80年代初期，早期的激光共聚焦

2、显微镜在技术上很不完善，其应用也受到限制。至到20世纪80年代末，光学系统设计不断改进，成像的质量和灵敏度都有所提高，进入90年代初，激光共聚焦显微镜系统中逐步引入混合激光和紫外激光技术。90年代末由美国Meridian公司推出的新型激光共聚焦显微镜系统，已具备完善的光学系统，模块化的仪器设计，灵活的软件和高配置的计算机硬件，从而使共聚焦显微镜系统的功能不断升级，应用的领域不断扩展。随着生命科学研究的不断深入及荧光探针技术的迅速发展，共聚焦显微镜将推动生命科学研究的迅速发展，同时生命科学研究的进展也将使激光显微镜技术不断改进和完善。激光共聚焦显微镜的特点激光共聚焦显微镜是现今最为先

3、进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能，并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图像，并可以任意角度旋转，观察细胞，组织的立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观察和测量的梦想成为现实。光学显微镜显微镜的基本原理普通显微镜的基本结构和原理荧光显微镜的基本结构和原理

4、激光共聚焦显微镜基本结构和原理显微镜的基本结构光学系统机械装置显微镜的基本结构光学系统（1）目镜有一组透镜组成目镜，可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的视场大小目镜可分为：普通目镜；广角目镜两种（2）物镜它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，主要有10X、20X、40X、60X、100X等（3）光源有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。（4）聚光器　包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成，它可以集中透射过来的光线，使更多的光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围，用以调节光的强度

5、。显微镜的基本结构（1）机架显微镜的主体部分，包括底座和弯臂。（2）目镜筒　位于机架上方，靠圆形燕尾槽与机架固定目镜插在其上。根据有否摄像功能，可分为双目镜筒和三目镜筒；根据瞳距的调节方式不同，可分为铰链式和平移式。（3）物镜转换器　它是一个旋转圆盘，上有3～5个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。（4）载物台　是放置玻片的平台，其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。右下方有移动手柄，使载物台面可在XY双方向进行移动。（5）调焦机构　利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，从而使被观察物体

6、对焦清晰成像。（6）聚光器调节机构聚光器安装在其上，调节螺旋可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱。光学显微镜的分类光学显微镜的分类光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。明场观察微分干涉衬DIC浮雕相衬RC相衬（相差）暗场观察荧光观察偏光观察荧光

7、显微镜的基本结构和原理荧光显微镜的构成荧光显微镜的基本结构和原理光源激发滤片、双色反色镜、阻断滤片物镜、目镜汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)荧光显微镜光源氙灯光源：高峰值更宽，更稳定荧光激发块镜组A激发滤色镜C吸收滤色镜B分光镜吸收滤色镜激发滤色镜分光镜BT%AC荧光显微镜的分类透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得