实时荧光pcr技术在动物疫病诊断中的应用

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1、近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的应用得到了进一步的发展，在诊断动物的病毒性、细菌性和寄生虫性疫病中得到了广泛的应用。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，实时荧光PCR技术将会在动物疫病诊断中得到更加广泛的应用。实

2、时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前报道的荧光探针主要有Taqman，Amplisensor，分子标信，Lightcyclor以及在这4种探针基础上发展起来的荧光探针。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且与常规的PCR相比，具有灵敏性和特异性高，能实现多重反应、自动化程度高、无污染

3、、实时和准确等特点。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域，特别是近几年来在动物疫病的诊断中得到了广泛的应用。1诊断病毒病1.1禽流感禽流感病毒变异极为频繁，血清亚型众多，已报道的有15种血凝素HA亚型（H1～H15）和9种神经氨酸酶NA亚型（N1～N9）。禽流感病毒呈世界性分布，绝大多数禽流感病毒呈隐性感染，不表现临床症状，只有少数禽流感病毒具有迅速传播和高致病性的特性。国内外检测禽流感病毒的方法是OIE推荐的鸡胚病毒分离方法，该方法约需要耗时21d，不适合禽类进出口的检疫和发生疫情时的及时诊断。张鹤晓等[1]根据A型流感病毒

4、的核酸保守区共有序列，开发、设计多条引物和探针序列，从中筛选敏感、特异的引物和探针，在循环参数、病毒核酸的提取方法、反转录条件的基础上，建立了快速的通用型“一步法”检测所有A型流感病毒的通用型荧光RT-PCR。该方法与鸡胚病毒分离相比，敏感性基本一致，可直接用来检测泄殖腔、喉拭子和禽肉，将检测时间从原来的21d缩短为4h。朱文斯等[2]根据禽流感病毒H5亚型的RNA4节段设计了检测禽流感病毒H5亚型的引物和探针，其敏感性最高能达到10-7，该方法特异性强，与传染性法氏囊病毒中等毒力及弱毒疫苗、新城疫弱毒疫苗、传染性支气管炎弱毒疫苗、鸭

5、瘟弱毒疫苗、鸭病毒性肝炎弱毒疫苗及有可能感染的禽流感病毒H9亚型、新城疫强毒、鸡传染性贫血病毒均不反应。1.2新城疫新城疫病毒属于副黏病毒，根据毒株的致病力可分为强毒力型、中等毒力型及弱毒力型。OIE推荐检测新城疫病毒的方法是鸡胚病毒分离方法，需要21d。张鹤晓等[3]建立的荧光RT-PCR方法不仅能将中强毒力新城疫病毒与弱毒区分开来，而且不与常见的禽类病毒发生交叉反应，其敏感性最高可达10-7。杨德胜等[4]利用荧光RT-PCR方法对910份样品进行新城疫病毒检测，阳性30份，并用鸡胚分离部分检测样品，结果完全一致。说明了荧光RT-

6、PCR方法检测新城疫病毒具有敏感、特异、快速、准确、安全等特点。1.3口蹄疫locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame口蹄疫是一种危害偶蹄动物的烈性传染病，被OIE列为A类动物传染病

7、之首。口蹄疫的暴发曾经给世界许多国家和地区的畜牧业及国际动物贸易带来灾难性的损失。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，为单股正链，血清型复杂多变，有7个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Aasia1型。传统的病毒分离鉴定方法耗时长，敏感性和准确性都较差，ELISA方法敏感性低，常规RT-PCR在大量样品进行检测的过程中容易被污染，以上方法难以适应当前口蹄疫防疫工作的要求。建立一种快速和可靠的诊断方法，对于控制和消灭口蹄疫至关重要。花群义等[5]根据口蹄疫病毒聚合酶3D基因片段非常保守的区域设计的引物、探针，扩增区内口蹄疫病

8、毒O型、A型、C型、Asia1型、SAT1～3型的序列相同，引物和探针是通用的，建立了荧光RT-PCR方法，对细胞培养物、水疱液、水疱皮及分泌物进行了检测，得到了满意的结果，与其他水疱性病毒不发生交叉反应。杨素等[6]应