LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用.doc

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1、LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用【摘要】目的：建立一种环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)反应快速检测沙门菌的方法。方法：根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(GenBank)上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA(登录号：M90846和M18283)基因序列，设计特异引物，提取标本DNA，然后以LAMP技术扩增invA基因，PCR方法扩增fimA基因，采用琼脂糖电泳观察结果。结果：91份血培养阳性报警瓶，LAMP和PCR法检测出阳性18份，与最终培养结果一致；

2、30份粪便标本，LAMP和PCR法检测出阳性5份，培养阳性3份，LAMP测限达到102CFU／mL。结论：LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。【关键词】沙门菌环介导等温扩增（LAMP）核酸沙门菌(Salmotlella)是肠杆菌科中一种重要的人兽共患病病原菌，是引起伤寒、肠炎等多种疾病的重要病原菌。目前，对于沙门菌的检测普遍采用培养、生化和血清学鉴定等方法，报告阳性结果至少需要3～5天，且较为繁琐、费时费力。而酶联免疫吸附试验、肥达试验、凝集试验、免疫电泳、PCR等方法均存在对检测标准的特殊要求以及特异性

3、方面的不理想等因素[1,2]。我们应用环介导等温扩增（LAMP）反应快速检测沙门菌，报道如下。1材料与方法1.1试剂和仪器核酸扩增仪（MyGetleThermalCycler，杭州朗基科学仪器有限公司)，BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)，PCR试剂盒(Takara公司)，得灵Walkaway96全自动细菌鉴定仪，BacT/Alert全自动血培养仪及其配套的血培养瓶(法国生物梅里埃公司产品)。1.2标本和菌株来源91份阳性血培养瓶和30份粪便标本均来自温州医学院附属第二医院细菌室。鉴定特异性的参照菌株除标准ATCC菌株购

4、自卫生部临床检验中心，其它菌株均为温州医学院细菌室临床鉴定菌株。1.3引物针对鼠伤寒沙门菌的invA和fimA基因(GenBank登录号：M90846和M18283)分别设计特异LAMP和PCR特异引物(上海生工合成)。1.4阳性血培养瓶中细菌DNA模板提取采取盐酸胍苯甲醇法[3]：①从阳性血培养瓶中以无菌方式取100μl培养物置入1．5ml的EP管中，然后加入5M盐酸胍缓冲液100μl，涡旋振荡5min；②依次加入400μl双蒸水和800μl苯甲醇，涡旋振荡1min，然后在4℃下以700×g离心5min；③取上层水相约0.4ml到一新Ep管

5、，依次加入3M醋酸钠缓冲液40μl和异丙醇0．44ml，然后在4℃T16，000×g离心15min；④倒掉上层液体，加入1ml70％乙醇洗涤，然后在4℃4T16，000×g离心10min，接着倒掉上层的乙醇，待自然干燥后加入100μl双蒸水溶解管底的DNA沉淀备用。1.5粪便标本细菌DNA直接提取按照文献[4]进行。1.6绵羊血琼脂平板上菌株的DNA提取挑取1个以上纯菌落置入内含100μl裂解液(蛋白酶K浓度为200ng／ml的0．5％NP40溶液)的0．5ml离心管内，56℃水浴1小时，95℃水浴消化15min，然后14，000r／min，

6、离心30秒，上清液即为PCR扩增检测的模板液。1.7标本检测对阳性血培养瓶和粪便培养标本提取的细菌DNA进行LAMP和PCR检测，并同时对上述标本进行传统方法鉴定，根据沙门菌分型抗血清和生化鉴定结果确诊沙门菌。LAMP反应体系(25μl)中包括1.6μmol／L的引物FIP和BIP,0.2μmol／L的引物F3和B3，1.2mmol／L的dNTP，4mmol／LMgSO4，1×thermopolbuffer(NewEnglandBiolabs)，0.8mol／Lbetaine和2.5μl的模板，反应条件为：先95℃5min，然后冰上冷却，再加入

7、8UBstDNA聚合酶1μl，63℃恒温1小时，最后80℃，3min终止反应。PCR反应体系(25μl)条件为：0.2mmol／L的dNTP、1．25U的Taq酶0．4μmol／L的正反向引物、1．5mmol／L的Mg2+和3．0μl的模板。反应条件为：先94℃2min，再按94℃1min→52℃30s→72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。两种方法产物分别在含溴化乙啶的2％琼脂糖中电泳后，用凝胶成像系统观察结果并照像。1.8特异性和最低检测限分析将由参照菌株提取的DNA进行LAMP和PCR扩增，以检测特异性；将临床鉴定鼠伤寒沙门

8、菌接种于绵羊血琼脂平板过夜培养，然后挑取菌落制备一系列浓度的菌悬液提取模板DNA，最后以LAMP和PCR扩增各浓度模板中的相应特异基因。2结果2.1临