高产番茄红素酿酒酵母的设计构建与发酵过程优化

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1、ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中国第－臓代大学ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博士学位论文＿Ｊ，＿１細綱＿级学科化学工程与技术：生物化工学科专业：作者姓名：陈艳指导教师：元英进教授天津大学研究生院２０１７年５月高产番茄红素酿酒酵母的设计构建与发酵过程优化Designandconstructionoflycopene-overproducingSaccharomycescerevisiaeandfermentationprocessoptimization一级学科：化学

2、工程与技术学科专业：生物化工作者姓名：陈艳指导教师：元英进教授天津大学化工学院二零一七年五月中文摘要异源代谢路径和底盘细胞的适配性是异源微生物合成的关键因素。本研究以构建高产番茄红素的酿酒酵母为目标，对底盘细胞和异源路径进行理性设计和交互优化，极大地提高番茄红素产量和纯度。与此同时，针对改造过程中发现的关键遗传靶点YPL062W对萜类物质生产的影响进行了系统表征，重新注释了它的生物学功能。首先，以酿酒酵母CEN.PK2为宿主细胞构建诱导型番茄红素异源合成路径。通过两种增强型GAL诱导策略（Δgal1Δgal7Δgal1

3、0、Δgal80）比较，发现前者更有利于番茄红素合成。在此基础上，敲除ypl062w使得番茄红素产量提高1.5倍，同时乙酸积累大量减少，甲羟戊酸（MVA）途径关键前体乙酰辅酶A的含量增加约1倍，因此敲除ypl062w的酿酒酵母作为后续研究的底盘细胞。此外，我们发现敲除ypl062w能够有效提升酿酒酵母合成单萜、倍半萜、二萜、三萜及四萜的产量，具有普遍性。通过转录组分析发现敲除ypl062w主要从上调乙酰辅酶A合成、MVA路径、异源基因表达、能量合成、细胞膜关键组分合成这五个方面强化异源萜类合成。而且，YPL062W并不

4、发生转录，而是属于ALD6的核心启动子，且ALD6表达量与萜类化合物产量呈负相关关系。因此，YPL062W主要通过调控ALD6转录作用于萜类合成。在强化前体物质供给的底盘细胞基础上，进一步优化番茄红素合成路径，即通过5种CrtE、2种CrtB和3种CrtI的来源组合筛选强化异源路径通量，获得产量最优的路径基因组合；并利用启动子强度和整合拷贝数微调途径限速酶BlakesleatrisporaCrtI，提高番茄红素占总类胡萝卜素的比重。最后，再优化底盘细胞，即通过考察不同交配型的酵母底盘细胞以及远端遗传基因座对番茄红素合成

5、的影响，进一步优化产量；通过上调胁迫响应因子INO2增强酵母对番茄红素的耐受能力；通过引入异源血红蛋白基因VHb提高细胞和产物得率。经过上述适配优化，番茄红素产量提高近30倍（从2.43mg/gDCW到66.14mg/gDCW），且其占总类胡萝卜素的比例达到91.41%。最终经发酵过程（培养基、补料方式、溶氧控制）优化，在50L发酵罐补料分批试验中，番茄红素产量达到2.75g/L，是目前酿酒酵母中的最高产量。关键词：番茄红素，酿酒酵母，底盘细胞改造，异源路径优化，适配性，YPL062WIABSTRACTThecompa

6、tibilitybetweenheterologousmetabolicpathwayandhostcelliscriticaltoheterologousmicrobialproduction.Here,withtheaimoflycopeneoverproductioninSaccharomycescerevisiae,bothhostcellandheterologouspathwayweredelicatelydesignedandcombinatoriallyoptimized,andconsequently

7、lycopeneoutputandpurityweredrasticallyimproved.Inthemeanwhile,theeffectofYPL062W,akeygenetictargetengineeredinthisstudy,onterpenoidsproductionwassystematicallyelucidated,andthebiologicalfunctionofYPL062Wwasre-annotatedaswell.Firstly,S.cerevisiaeCEN.PK2wasusedash

8、ostcellandinducibleheterologouslycopenepathwaywasintegrated.BycomparingtwostrategiesofincreasingtheinductionefficiencyofGALexpressionsystem(Δgal1Δgal7Δgal10andΔgal80)