诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

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1、诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究山东省济宁市第一人民医院(272111)刘俊宾上海市黄浦区中心医院(200002)蓝首利湖北省武汉市华中科技大学附属同济医院(46003田夏仁云摘要目的研究和评价转化生长质明胶(BMG)呈海绵状,-20℃保存，使进行细胞传代，并计数细胞个数。第10因子一P}(TGF-P)和胰岛素样生长因子-用前紫外线照射12小时灭菌天细胞长满了瓶壁，在进行细胞传代，即I(IGF-I)在BMG三维支架中对骨髓1.2骨髓基质干细胞分离用。25%胰蛋白酶清洗贴壁的细胞，将基质千细胞(SMCS)向软骨细胞分

2、化的影按Kadiyala等Pi描述的方法，取健康未贴壁的死细胞及分泌代谢产物清洗倒响。方法从大白兔的骼骨骨髓液中提取2月龄大白兔2-2.5千克(同济医学院实出，再往瓶内加入0.2595胰蛋白酶3-和分离骨髓基质干细胞，将无血清Mc5A验动物中心)，雌雄不限。氯胺酮十异丙嗅5.1，放人培养箱中2-3分钟，观察瓶内培养液分为四组，含有5ng的TGF-P,肌注麻醉，双侧骼部剪毛后碘伏消毒，在贴壁的细胞已分离成为悬浮的圆形细和100ng的IGF一I组为A组、含有无菌条件下用16号骨穿刺针在骼骨翼胞，轻轻倒出胰酶，加入5.1上迷的四种

3、TGF-p.为B组含有IGF-1组为C组及外侧穿人骨髓腔，注射器针管内预先含不同的无血清Mc5A培养液。在无菌条无血清Mc5A培养液为D组作为空白对有0.1.[肝素钠生理盐水，抽吸骨髓液件下，将约7x7mm2大小的块状BMG支照，先进行单层细胞培养的10天，再置6.1移人Mc5A培养液5m1的离心管内架置人每个孔内，使悬浮的细胞液覆盖于松质骨基质明胶(BMG)支架中继续培混匀，1500r/min离心5分钟，弃上层于支架上，第20夭时观察BMG支架中养10夭，然后进行甲苯胺蓝染色、蛋白脂肪和上清。加人适量无血清培养液悬细胞形态

4、及分布，收集BMG支架低温储多糖含量的测定。结果第5,10天后，各浮细胞，缓慢移人盛有比重为1.077淋巴存，以备检侧组单层细胞培养的细胞个数均有显著性细胞分离液的离心管中(细胞培养液与2.检测指标差异，即A组>B组)C组>D组;第20天细胞离液之比1:1)，以2000r/min离心后各组的BMG支架蛋白多糖含量检测20分钟.小心吸取界面的有核细胞乳白2.1大体及倒置显微镜观察结果，即A组>G组>B组>D组(P<层加人Mc5A培养液10.1,制成细胞悬第5,10夭时倒置显微镜下观察细0.05)。结论旱期应用TGF-p可提高骨

5、液移人25c.'培养瓶中，置于37`C,50k胞贴壁生长及增殖的情况，对各组增殖髓基质千细胞的软骨分化能力，而IGF-CO,及饱和湿度培养箱中培养，倒置显微细胞的数量进行对比I可提高TGF-Pj对骨髓基质干细胞软镜下观察呈形态一致的均质分布均匀的2.2电镜扫描骨分化作用细胞，可用于BMSC收集和移植。计数每随机取出一个制备好的BMG支架瓶中含有【.5x10'个细胞/m{时，收集作电镜扫描;在BMG支架中培养的细1.材料和方法的骨髓MSc低温存储中。胞，第20天后，进行电镜扫描观察细胞1.1松质骨基质明胶(BMG)的制备13培

6、养和诱导MSc生长分布情况及增殖的密度。按沈静如制备的方法加以改进，在以每瓶中含有1.5x10'个细胞/ml开2.3硫酸氨聚多糖(glycosaminogly-无菌条件下，切取2月龄新西兰大白兔始诱导培养，在24孔培养板中培养，分为cansGAG)含最骼骨，去筋膜及皮质骨，剩下的松质骨，四组.每组10个孔，孔内加人含有5ng/将各组BMG标本解冻后，用滤纸吸用5mmol/LNaN,洗去血液，并浸泡24m1TGF-(3和100ng/mlIGF-I无血清干组织所带的水，电子天平称量组织湿小时用1:1氯仿甲醇反复脱脂直至液体Mc5

7、A培养液作为A组，加人含有5ng/重。二甲基亚甲基蓝比色法测定标本的清亮后，风浴挥发。Lommol/1盐酸进行mlTGF-p无血清Mc5A培养液为B组GAG含量，每克湿重组织中GAC含量按脱钙48小时，再次脱脂过夜.风浴挥发。(5ng/ml为TGF-p，对MSG软骨诱导的r列公式计算硫酸GAG含量(mg/g卜依次用2mol/LCaC1210.5mo1/LEDTA最佳剂量已得到证明)，加人含有l00ng硫酸GAG量(mg)/组织湿重(引溶液浸泡,4mol/LLiCl连续抽提24小/mlIGF-I无血清Mc5A培养液作为C2.4

8、组织学观察时，用三燕水反复0洗除去残余试剂。以组，不加任何试剂的无血清Mc5A培养冷冻标本解冻后，在4℃下用PBS浸无水乙醇，无水乙醚脱水、制成松质骨基液作为D组作为空白对照组。第5天时泊1小时再酒精脱水，石蜡包埋，困成2007.11!36万方数据611.切片，常规HE染色，甲苯胺兰染B组