猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究

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1、硕士学位（毕业）论文猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究学位申请人：刘宝京指导教师：范京惠副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二○一八年六月一日分类号：S855.3单位代码：100860密级：公开学号：20152200401猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究StudyonIsolation,IdentificationandBiologicalCharacteristicsofPorcineDeltacoronavirusHB-BDStrain学位申请人：刘

2、宝京指导教师：范京惠副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二○一八年六月一日摘要猪丁型冠状病毒（PorcineDeltacoronavirus，PDCoV）是一种新发现的猪肠道病毒，可引起以水样腹泻、呕吐、脱水和仔猪死亡为特征的肠道疾病。2012年，PDCoV首次在我国香港被发现，随后该病于2014年在美国爆发。目前PDCoV在世界许多国家都被检测到，据报道，在我国的部分省份猪场中也检测到了PDCoV，该病毒已经成为严重影响养猪业健康发展的新发病原。本研究将RT-PCR检测为PDCoV阳性

3、的腹泻样本接种ST细胞进行病毒的分离传代。通过观察其细胞病变，RT-PCR、病毒滴度的测定和间接免疫荧光的鉴定，结果成功分离到1株能在ST细胞上稳定增殖并能产生明显细胞病变（CPE）的猪丁型冠状病毒（HB-BD毒株）。通过RT-PCR对其全基因进行了扩增，除去3’端poly(A)，基因组全长为25420bp，基因结构为5’UTR-ORF1-S-E-M-NSP6-N-NSP7-3’UTR，每部分的碱基数分别为540nt，18803nt，3480nt，252nt，654nt，285nt，1029nt，603nt和392nt。全基因

4、序列分析显示，HB-BD株与参考株之间的同源性为97.2%-99.5%，并与PDCoV/NH株之间的同源性最高（99.5%）；进化树分析表明，HB-BD株与其他PDCoV参考株同属于δ冠状病毒属，并且与中国毒株的亲缘关系比美国、韩国和泰国毒株近。以纯化的重组PDCoVS1蛋白作为包被抗原，通过对反应条件进行优化后，建立了检测猪血清中PDCoVIgG抗体的间接ELISA方法。优化结果显示，该方法的抗原最佳包被浓度为1.0µg/mL，血清稀释倍数为1∶200，封闭液为含5%胎牛血清的PBST工作液。酶标抗体最佳稀释度为1∶2000

5、0。一抗和二抗的孵育时间均为37℃作用1h；底物显色时间为15min。通过30份阴性血清，得出阴阳性临界值为0.369。特异性试验表明，该方法不与PEDV、TGEV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV等常见猪病毒阳性血清发生交叉反应；重复性试验表明，批内和批间重复性试验的变异系数都小于10%，具有较好的特异性和重复性。ROC曲线分析得出，与westernblot相比，该方法的敏感性和特异性分别为100%和92.3%。上述试验结果表明，本研究建立的重组S1蛋白间接ELISA方法具备检测PDCoV抗体的可行性。应用建立的间接E

6、LISA方法，对2017年1月至2017年12月份收集的来自河北部分地区的542份猪血清样品进行检测，样本阳性率为18.6%。鉴于目前尚无有效的治疗方法或疫苗可用于控制PDCoV。本研究为探讨依靠RNA干扰（RNAi）技术对PDCoV体外增殖的抑制作用，分别构建了针对PDCoV的M和N基因的两个shRNA表达质粒（pGenesil-M和pGenesil-N），并转染入ST细胞，进行基因干扰实验研究。分别对转染组和对照组进行TCID50检测，以及对CPE进行观察和荧光定量PCR检测，测定结果表明两种shRNA表达质粒（pGene

7、sil-M和pGenesil-N）均能够抑制PDCoV在ST细胞上的增殖，且pGenesil-N表达质粒的抑制率要高于pGenesil-M表达质粒。综上所述，本研究对PDCoVHB-BD毒株进行了分离鉴定以及全基因序列分析，并根据S1蛋白建立了间接ELISA方法，对2017年河北省部分地区的血清样本进行了检测，以及对RNAi技术抑制PDCoV体外增殖进行了研究。本研究为PDCoV的遗传进化、致病性等研究奠定了基础，也在流行病学调查、疾病的诊断、疫苗的研制和防治工作方面具有重要意义。关键词：猪丁型冠状病毒；分离鉴定；序列分析；E

8、LISA；RNA干扰StudyonIsolation,IdentificationandBiologicalCharacteristicsofPorcineDeltacoronavirusHB-BDStrainAuthor:LiuBao-jingAdvisor:Profess