水稻抗病基因同源序列多态性与品种鉴定

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1、种子Seed2001年第2期(总第114期)·研究报告·X水稻抗病基因同源序列多态性与品种鉴定孙雁王云月何月秋朱有勇(云南省植物病理重点实验室昆明650201)摘要:利用已知植物抗病基因不同保守序列设计的S1öAS3和XLRRforöXLRRrev两对引物对22个水稻品种DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析结果表明:水稻抗病基因同源序列类型丰富,2对引物共扩增出143条带,品种间有差异的谱带92条,根据谱带差异可将供试品种完全鉴别出来。证明抗病基因同源序列分析可以用于水稻品种鉴定。关键词水稻抗病基因同源序列多态性品种鉴定种子真实性和纯度

2、是评价种子质量优劣的重要指标,做好品种鉴定工作对于品种资源利用、种子生产、种子贸易和进行植物品种保护具有重要意义。目前鉴定水稻品种的方法有种子形态鉴定、化学鉴定、幼苗形态鉴定、田间种植鉴定、同工酶电泳、蛋白质电泳[1,2]和以DNA分子杂交、PCR技术为核心的DNA指纹鉴定,田间种植鉴定是国内外采用的标准方法。随着新技术应用和育种进程的加快,水稻品种数量急剧增加,传统的形态鉴定和常规的同工酶、蛋白质鉴定因可供识别的性状或位点较少,凭据单一的手段难以准确、快速和有效地完成品种鉴定工作,而不断发展和完善的DNA指纹技术直接对基因组DNA进行扫描,在品

3、种鉴定方面显示出巨大的优越性。[3]近年来已在不同植物中克隆了30个抗病基因,对这些基因的序列及所推测的氨基酸序列的分析结果表明:抗病基因存在一些共同结构,如核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复子(LRR)和丝氨酸ö苏氨酸蛋白激酶(STK),但又具有各自的特点。根据抗病基因的保守序列设计引物或简并引物,在任何作物中应用PCR技术扩增和分离具有相似序列的DNA片段,即抗病基因同源序列(resistancegeneanalogue,RGA),[4]已成为一条快速鉴定候选抗病基因和评价抗病种质遗传资源的新途径。本文利用抗病基因同源序列方法对22个水稻

4、品种进行分析,探讨水稻抗病基因同源序列多态性及其在水稻品种鉴定上的应用效果。1材料与方法1.1材料供试水稻品种22份,均为云南省生产上正在使用的籼稻品种(表1)。1.2DNA提取表1供试材料名称和类型取25～30℃下培养15天的水稻幼叶,参考编号品种名称类型编号品种名称类型编号品种名称类型[5]1Ê优501籼杂9冈优22籼杂17滇超601籼Zheng等人的方法提取水稻基因组DNA。2Ê优多系1号籼杂10Ê优838籼杂18滇超101籼1.3抗病基因同源序列(RGA)分析3金优桂99籼杂11优É晚3籼杂19金优晚3籼杂选用拟南芥RPS2基因和烟草N基

5、因的4Ê优6078籼杂12冈优12籼杂20K优802籼杂5汕优149籼杂13C优22号籼杂21汕优晚3籼杂NBS2LRR区域设计的S1öAS3和水稻Xa21基因6Ê优7号籼杂14Ê优130籼杂22辐优130籼杂的LRR区域设计的XLRRforöXLRRrev两对7长粒糯籼糯15紫糯籼糯[6]8汕优63籼杂16滇新10号籼糯引物,参照Chen等人的方法从水稻总DNA中扩增抗病基因同源序列,分别用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增效果和分离抗病基因同源序列,采用Promega公司的DNA银染系统进行RGA显色。1.4聚类分析以“1”和“0”

6、分别表示水稻品种抗病基因同源序列扩增片段的有和无。使用Statistica软件中的欧氏距离(Euclideandistances)和非加权成对分组平均法(Unweightedpair2groupaverage,UPGA)程序进行聚类分析,差异相似性=(dlinködmax)×100。2结果与分析2.1抗病基因同源序列的多态性通过22个水稻品种的抗病基因同源序列分析,发现2对RGA引物在供试品种中共扩增出143条带,品种间有差异的谱带92条,主要分布于100～1100bp(图1、图2),多态性比例为64%(表2)。2.2水稻品种相似性分别以每对RG

7、A引物扩增出的水稻抗病基因同源序列进行聚类分析,检测品种间的相似程度。结果显示22个水稻品种在不同RGA引物聚类图中所属的类群和相似性程度不尽相同(图3、图4)。这可能与引物的碱基序列不同,在扫描基因组DNA时识别X国家863项目(Z162032M)、云南省科技攻关项目和国际水稻所合作项目(IRRI2ADP37)资助·1·种子Seed2001年第2期(总第114期)位点和扩增片段的大小不同有关,特别是AS3引物中存在6个次黄苷酸(I),该碱基能与模板DNA中的任何一个碱基配对,使AS3表现出较强的亲和性。供试品种在S1öAS3中的不相似程度为25

8、%～100%、在XLRRforöXLRRrev中的不相似程度为30%～100%,说明品种间的差异较为明显。以上结果表明:水稻抗病基因同源