抗体的分离纯化原理和测定

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1、第八章抗体的分离纯化及测定食品学院廖振林第一节抗体的分离纯化无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。纯化：提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。对治疗性抗体尤为重要。分离纯化的方法可依据抗体的特性进行分离纯化：据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法将抗体与其他蛋白分开；据抗体带有电荷的不同，用离子交换，电泳等技术分离…..按分离方法：沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离即纯化。一、盐析法（一）原理蛋白质的溶解度在一定范围内随

2、盐的浓度变化而变化。在低盐浓度下溶解度随着盐浓度升高而增加，当盐浓度达到一定水平时，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白质分子的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水个溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷被中和，水化膜破坏，致使蛋白质分子相互聚集而沉淀。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不同面达到彼此分离的方法。（二）盐的选择蛋白质盐折常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小，

3、溶解度大(25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L)。在不同饱和度的硫酸铵溶液内，不同蛋白质依次析出，而且硫酸铵价廉易得，分段效果好，不容易引起蛋白质变性。硫酸铵浓溶液的pH常在4.5—5.5之间，市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。(三)盐析时需注意的问题1.盐的饱和度盐的饱和度是影响蛋白质盐析的主要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由低到高逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白

4、，当饱和度达20％时，纤维蛋白原首先析出；饱和度增至28％—33％时，优球蛋白析出；饱和度达33％—50％时，球蛋白析出；饱和度大于50％以上时，清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱和皮为33％开始析出。2.pH在等电点时，蛋白质溶解度最小．容易沉淀析出。因此，盐析时除个别特殊情况外，pH常选择在被分离的蛋白质等电点附近。3.蛋白质浓度在相同盐析条件下，蛋白质浓度越高越易沉淀，高浓度虽对沉淀有利，但浓度过高，也容易引起其它蛋白质的共沉淀，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉淀作用的干扰。4．温度出于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，但在使用

5、某些中性盐进行盐析时，温度对盐溶解度的影响比较明显。5.脱盐蛋白质用盐析沉淀分离后，常需脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析。通过透析袋内外的离子交换，最后使透析袋内溶液的盐浓度与外界相一致。当然，也可以使用凝胶过滤或超滤的方法除盐。二、膜分离技术可以形象地将膜分离技术比喻成以多孔膜进行过滤或过筛子的过程。在实际操作时，由于膜上的孔很小，需使用一定的压力，才能将含有待分离物质的液体驱动通过分离膜，使具有不同分子量的物质或通过膜、或截留于膜上而得到分离。有多种膜技术可用于抗体的分离与纯化。但最基本的是使用超滤膜。超滤膜的孔径在1—100nm之间，其截止到分子量的范

6、围为几百至一百万，所需的驱动压力在0.1—1.0MPa左右。(一)超滤膜的基本性能作为膜分离材料，超滤膜的基本性能可以用透水率和截留分子量加以表征。1．透水速率在一定的驱动压力下，单位面积的膜在单位时间里所能透过的水的量称为该膜的进水率(Jf)。式中Jf为进水率，ρ为渗透系数，ΔP为压力差，Δπ是料液的渗透压差，ι是透过水流通道的长度，它正比于膜的厚度。通常情况下，由于Δπ很小，所以可以忽略不计、此时，透水率可简化表达为即透水率与操作压力成正比，与膜厚呈反比。由于膜在使用过程中会发生污染和孔结构的改变，因而在使用过程中，其透水率会逐渐发生变化。所以定义其初始运水量Q

7、z和稳定透水量Qs之比为稳定系数Sm，即一般情况下，Sm=0.6-0.8,不同规格和品种的膜的透水率相差很大。同时，不同的操作条件与参数，也会对实际透水量产生影响，这些参数包括操作压力、料液流速、温度以及料液的性质等。一般情况下，在膜使用的开始和结束时，可以实际测定一下透水率。当透水率已经降低时，应考虑将其清洗并再生，以恢复其透水率。2．截留分子量超滤膜的另一基本性能是标称截留分子量。它的定义是指溶液中被截留的溶质中最小的分子量。对于“截留分子量”这个指标，不应做机械式的理解。例如，使用截留分子量5万的膜时，分子量68万的牛血清白蛋白也可通透过去。这是因为，一方