鸡卵黄抗体IgY的分离纯化及鉴定.pdf

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1、第26卷第6期生物学杂志Vo1．26No62009年12月JOURNALOFBIOLOGYDec，2009doi：10．3969／j．issn．1008—9632．2009．06．080鸡卵黄抗体IgY的分离纯化及鉴定李敏惠，邹强。，杨淑霞，何建荣，刘阳，黄雅琳，常山(成都医学院：1．科研实验中心，2．第一附属医院骨科，3．免疫学教研室，四川成都610081)摘要：采用水溶稀释法结合硫酸钠二次盐析沉淀法分离纯化鸡卵黄中蛋白IgY，实验中比较了不同pH值的水溶稀释液对卵黄除脂效果的影响；并采用SDS—PAGE及westernblot

2、ting对提取产物进行鉴定。结果显示，pH值5．2水溶稀释液除脂效果最好，IgY得率最高。实验优化了鸡卵黄抗体IgY分离纯化技术，得到的IgY产量高、纯度高，特异性强；此外，水溶稀释法制备IgY具有利用小体积样品获得大量蛋白及纯化效率高的优点。关键词：IgY：分离纯化；鉴定中图分类号：R392．33文献标识码：B文章编号：1008—9632(2oo9)06—0080—03鸡卵黄抗体(Immunoglobulinofeggyolk，IgY)是鸡黄膜，收集蛋黄液。卵黄中存在的免疫球蛋白，是由鸡血液中的IgG转移1．2．2水溶稀释法制备

3、蛋黄水溶性成份(watersolu—至卵黄中对子代产生保护性作用的抗体⋯。IgY的结blefraction，WSF)将分离得到的蛋黄液，加入9倍构与IgG相似，但相对于哺乳动物IgG抗体而言，因为体积酸化无菌去离子水(pH值6．2～4．6，见表1)稀卵黄抗体IgY具有动物种系发生学距离的优势，更适释，搅拌均匀，4℃过夜。次日离心(4℃，15000r／min，于生产特异性抗体，具有开发潜能。目前，抗轮状病15min)，取上清水溶成分。毒的特异性抗体IgY已经应用于临床防治轮状病毒性1．2．3硫酸钠两步法盐析蛋黄上清水溶成分中加肠炎的

4、发作与发展。另外，由于lgY制备成本低、产量入硫酸钠至终浓度18％，室温下放置lh，10000r／min，高、提纯简便快捷，并具有耐热、耐酸、稳定性好等优15min离心得沉淀；再将沉淀溶于原体积的PBS中，并加硫酸钠至终浓度14％，溶解后，放置1h，离心得沉点，这使卵黄制品的消毒及经口服防病治病成为可能。近年来，已有很多口服特异性IgY替代抗生素淀；沉淀溶于1mLPBS，透析过夜，过滤除菌，冻干后低温保存。成功治疗胃肠道疾病的报道。1．3蛋白含量测定1材料和方法用改进的Lowry蛋白分析试剂盒测定蛋白质含1．1试剂量。鸡蛋为罗曼鸡

5、鸡蛋；改进的Lowry蛋白分析试剂1．4SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳盒为Pierce公司产品(货号23240)；蛋白质分子量标分离得到的IgY用SDS—PAGE检测，浓缩胶浓度准购于Takara公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基乙为5％，分离胶浓度为15％，蛋白质片段用考马斯亮蓝二胺(TMEMD)为BBI公司产品；甘氨酸、SDS为Pro．R一250染色。mega公司产品；过硫酸铵为Sigma公司产品；乙二胺四1．5免疫印迹乙酸(EDTA)为Boehringermannheim公司产品；Tris碱蛋白样品经15％SDS—PAGE上分离

6、，转移到PVDF为NOVON(R&D)公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔膜上，与辣根过氧化酶标记的兔抗鸡IgGF(ab’)2酶抗鸡IgGF(ab’)2二抗购于Rockland公司(Code：303．标二抗进行westernblot分析。4304)。2实验结果1．2IgY制备及纯化2．1水溶解法粗提IgY1．2．1分离蛋黄液取鸡蛋，打一小孔，流出蛋清；从因为在酸性条件下脂类物质更易沉淀适合，为了小孔内加入无菌去离子水，以尽量去除残留蛋清，重复区别不同pH值条件下，水溶解法粗提IsY的差别，本3次；将蛋黄在滤纸上滚动，除掉表面的蛋清；刺

7、破蛋收稿日期：2008—12—08；修回日期：2009—02一O1作者简介：李敏惠(1977一)，女，硕士，讲师，E—mail：limy876@yahoo．tom．an；通讯作者：常山，男，硕士，副教授，主要从事外科感染及脊柱外科研究，E—mail：changshancmc@tom．coln。基金项目：四川省科技厅重点应用基础研究项目(05JY029-083)80第26卷第6期生物学杂志V01．26No．62009年12月JOURNALOFBIOLOGYDec，2009实验设计了9个pH值梯度，pH值6．2～4．6。稀释时，蛋白变

8、性，本实验采用先配制好酸化无菌去离子水，再为避免直接加入HC1时，局部过强的pH值变化导致以9：1的比例加入卵黄液。提取结果见表2。表1蛋黄水溶稀释液的pH值梯度Table1pHgradientfordilutedwatersolublefract