测定蛋白含量测定

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1、测定蛋白含量测定粗蛋白测定（凯氏定氮法）：水溶性蛋白测定：种子干燥后，研磨过60目筛，称取种子粉3.0000g，于瓷研钵中，加少量水研磨至匀浆，转入离心管中，放入50℃恒温振荡水浴中振荡提取30min，以4000r／min离心取上清液，用蒸馏水再洗残渣2次，重复以上过程，合并上清液（定溶到50mL），作为水溶性蛋白测定样品。球蛋白测定：在沉淀中再添加10%（W/V）氯化钠，重复提取3次，上清液（定溶到50mL）即为球蛋白样品。醇溶蛋白测定：在沉淀中再添加75%乙醇，重复提取3次，上清液（定溶到50mL）即为醇溶蛋白样品。碱溶蛋白（谷蛋白）测定：在沉淀中再添加0

2、.2%（W/V）氢氧化钠，重复提取3次，上清液（定溶到50mL）即为碱溶蛋白（谷蛋白）样品。最后，上述B、C、D、E样品采用同A的方法进行测定。微量凯氏定氮法原理：生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫

3、酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HCl＋NaOHNaCl+H2O本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应

4、室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网图3.4微量凯氏蒸馏装置示意图一、试剂浓硫酸；30％过氧化氢溶液；40%氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）。催化剂：硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO4、5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。指示剂：方法一：取50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。本指示剂的变色范围为紫红色

5、灰色绿色标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）；硼酸一指示剂混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1毫升左右混合指示剂）5%三氯乙酸二、测试样品：上述A：取0.3000g，B/C/D/E样品，按要求处理后，取5mL溶液进行消化。三、器材微量凯氏定氮仪；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）;烧杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角烧瓶150mL（×4）；凯氏烧瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；电炉；分析天平。操作方法一、样品处理准确称取烘至恒重的样品0.3000g，置10mL离

6、心管中，加入5mL5%三氯乙酸，在90℃水浴中浸提15分钟，不时搅拌，取出后用少量蒸馏水冲洗玻棒，待溶液冷却后，4000r/min离心15分钟。并用5mL5%三氯乙酸洗沉淀2-3次，离心，弃去上清液，最后用蒸馏水将沉淀无损地洗入铺有滤纸的漏斗上，去掉滤液，将沉淀和滤纸在50℃下烘干，用于蛋白氮的测定。二、消化取4只凯氏烧瓶，并编号，1号直接放入称好的样品0.3000g，用于测定总氮。2号放入上述烘干的滤纸和沉淀，用于蛋白氮的测定，3号放入同样滤纸一张，4号管不加任何样品作为空白对照，注意要将样品放入到底部。分别在每个凯氏烧瓶中加入约0.3-0.5g硫酸钾－硫酸

7、铜混合物，再加5mL浓硫酸。将样品浸泡数小时或放置过夜后，在管口盖一小漏斗，放在通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2~3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1~2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入100mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。若在消化中发现瓶壁上有黑色颗粒时，应小心地转

8、动消化管，用消化液将它冲洗下来，以保证