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《磁珠分选肿瘤干细胞操作规程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、肿瘤干细胞的分选工作0l2E%?-i(n4R9v(]一、消化4_-t%a)c7M'}"T)j4_0B（1）取出肿瘤组织，低温保存（离体组织冰上最多能保存多久仍可以用来分离CSCs？）（2）PBS漂洗，尽可能去除血细胞;^9B"{6G.W%b1a（3）放在DMEM/F12中尽量剪碎或剁碎组织3W,z:g#}-V$5Q+r%P（4）用胶原酶和透明质酸酶37°C 摇床中消化一小时（透明质酸酶是否必要？）5W-h)]-C4~'l)L%R（5）慢速离心，去上清。 DMEM/F12混悬沉淀，%H5s5r+r9m y+I（6）过滤（请问40微米筛是否可以？）。+B
2、9x,Q!Q;G0g!`（7）滤液用histopague-1077去除红细胞（据文献报道，请问是否有必要？）%L"l#Q1u)~3W;_（8）离心，沉淀用无血清CSCs培养液混悬。接着进行分选（请问细胞养一天影响大不大？）(n8O%b0g-]二、分选（据文献看流行的做法是磁珠分选，再流式检测纯度）,T't#-1}-V （1）负选：去除CD45标记的血干细胞及CD117、FAP标记的间质细胞（请问各位大侠是否做这一步？）9[)J(@:V0r:c(W （2）正选目的细胞1y+u(J.u F)5~"v9s6s-e7b(M5x;j磁珠分选步骤 G8a#a
3、7@!r6_试剂和设备：0N3Y(x)I.d.C2JBuffer：无Ca，Mg离子的PBS，PH7.2,含0.5%BSA，2mMEDTA,是用autoMACS稀释液（美天旎货号＃130-091-222）稀释MACSBSA储备液（＃130-091-376）制成，保持Buffer冰冷（4－8℃），使用前脱气，避免气泡堵塞分选柱。+8n5~7o4B一．磁性标记2z'Q%^/i u1M保持细胞冰冷，108或小于次数的细胞则使用下述体积试剂，磁性分选前获取较佳的单细胞悬液，可以将细胞通过40um尼龙筛，去除可能阻塞分选柱的细胞团块。高温和延长孵育时间会导致非特异性
4、细胞标记。+`#K&A*G!w!P*p*W/~)U1. 细胞计数0r9w-o7Q3
5、,N3T-i9K3M4e2Y,w2. 300×g离心细胞悬液，尽量去除上清,Y;Z9S7`4M:q-N3. 用350uLbuffer重悬#W/x+_+I'q*o*n#o0T#
6、4. 加100uLFcR封闭试剂/q }&M6g"z:F)d;N5. 加50uLCD133/1(AC133)-Biotin6i)(R4E6r%D5H5p6. 充分混合后冷处孵育10分钟（4－8℃）%]2H5h:z9B.w4N7.加50uLPE连接CD133抗体（#130-090-853）遮光冰箱孵育
7、5分钟(i:k;I2K(T8.用10-20倍标记样体积的buffer洗细胞300×g离心10分钟。充分洗,去上清。(N7Q4t2T1f9. 重复清洗细胞5g#c!X6f7D6`%}8Y10. 用400uLbuffer重悬细胞5}/`;E(w/@:@11. 加100uL抗生物素微珠.P#]#`&l8y*}"F2E12. 充分混合冰箱孵育15分钟3t-
8、*k)r*$m(k13.用10-20倍体积buffer洗细胞并300×g离心10分钟，充分吸去上清'c4B7}#V:14. 用500uLbuffer重悬细胞"_2S1N5R-@,e15. 继续磁性分选步骤5c7
9、l9M9h8k二．磁性分选1n:k"H+~!^4q&q8o1. 安装分选柱+Z8f$a%b1i3^!J2. 用500uLbuffer冲洗分离柱#R)A'o2I#o&d;O3.细胞悬液上柱6U.g!m,l0b'k,S4. 收集过柱的未标记细胞，用适量Buffer洗柱子，洗三次，每次等柱内Buffer流干再加，MS柱：3×500uL，收集总流出液。这部分就是未标记细胞组分;s2N.})Y%Q$d-S9_'l*u5. 将MS柱从分离器上取下，放在新收集管上.
10、+{5r/U9r8N/?6.加1mLbuffer到分离柱中，立即用活塞坚定地吹洗出磁性标记的细胞&q!Q8
11、_*]#K/} c2{0c,c7.要想进一步纯化CD133＋细胞，洗出的细胞可再次上柱，即用新分离柱重复1－6步骤注意：所有过程在超净台和冰上进行以保证细胞活力:S1_,R5q7R.T/f;T1．用冰预冷的MACSbuffer重悬108胶质母细胞瘤细胞7C,M0`"`)x2．用冰预冷的MACSbuffer洗几次:~)y/Q'Q:g/h3． 4℃下在90uL冰预冷的MACSbuffer中用PE－连接的CD133抗体10uL与5×105细胞结合30分钟（抗体浓度需要被调整）'{2?9K"H-e4．用MACSbuffer洗几次细胞!r#o'b&q4o*x0l6?
12、'N5．4℃用微珠连接的抗PE的抗体处理细胞30分钟
