重组人类精囊蛋白的制备及功能研究.doc

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1、重组人类精囊蛋白的制备及功能研究【摘要】目的制备重组精囊蛋白(semenogelin,Sg)，研究其对精子活动的影响。方法设计特异性的引物，用分子克隆技术从精囊cDNA文库中扩增精囊蛋白Sg，再将DNA插入质粒载体PET100，筛选序列正确的阳性克隆，转染BL21(DE3)大肠埃希菌，诱导表达重组人类Sg蛋白，用500g/LNi-NTA纯化重组蛋白，用正常人的通过上游法筛选出的活动精子行抑制分析，研究重组Sg在4种不同浓度0，1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL下对精子活动的影响。结果重组Sg在5ng/μL、10ng/μL浓度下明显抑制精子的运动(P<0.001)。结论

2、Sg分子明显抑制精子运动，精液液化过程中，必须清除Sg中具有抑制功能的片段，精子才能前向运动。【关键词】精子活动；前列腺特异性抗原；重组技术；精囊蛋白射精后的人类精液自发性凝固成最初的胶冻状态，随后的精液液化过程中，前列腺来源的蛋白激酶分解精液中的抑制精子活动的凝固蛋白，从而释放精子的运动。引起精液凝固的蛋白质主要是来自精囊分泌的含量丰富的精囊蛋白(semenogelin,Sg)，Sg具有抑制精子活动的作用［1-2］，其相对分子质量为52000，由精囊上皮细胞特异性分泌，在精囊中被蛋白C抑制剂(proteinCinhibitor,PCI)保护，以防被其他蛋白酶分解。射精后，Sg与精

3、子表面的附睾蛋白激酶抑制剂Eppin结合［3-4］，精液液化过程中，前列腺特异性抗原(prostate-specificantigen,PSA)将Sg分子中的抑制片段水解成许多相对分子质量<10000的小片段，精子才能开始活动。从精液中分离的许多Sg的水解片段具有各种各样的生物活性［5］，认识不同的Sg分解片段对精子的影响，对调控精子的获能及受孕极为重要，也可为进一步认识精液液化的分子机制提供重要帮助。本文利用分子克隆技术体外重组人类精囊蛋白Sg，研究其对精子运动活性的抑制。1材料与方法1.1实验材料本实验所用化学试剂和生物制剂均购自美国Sigma公司，PET-100质粒购自

4、Invitrogen公司，质粒纯化试剂盒(QiaquickPCRPurification)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)试剂盒购自美国Qiagen公司(Valencia,CA)，稳定素(P)购自Millipore公司(Bedford,MA)。1.2重组Semenogelin蛋白的制备在引物前端加上CACC碱基，以利于插入PET100载体，重组全长6-His-Semenogelin的引物：上游引物：5′-CACCGGTGGATCAAAAGGCCGATTACC-3′；下游引物：5′-CTATCGGCCATGCTGTTGATCTTG-3′。以精囊

5、cDNA文库为模板扩增Sg。用PfxPlatinium多聚酶(Invitrogen,Calsbad,CS)，在94℃变性15s，55℃复性30s和68℃延伸1min，共28个循环。为将PCR合成的DNA克隆到载体质粒PET100中，设置克隆反应体系，在Topo克隆反应中按照PCR产物DNA与Topo载体PET100分子比率0.5∶1到2∶1的比例加入，其组成：PCR产物4μL，盐溶液14μL，Pet-100载体1μL，总量6μL。轻轻混匀，常温孵育5min，然后转染Top10E.coli细胞。分析转染体，筛选阳性克隆，阳性克隆质粒基因序列均经DNA测序证实正确后，转染E.coliB

6、L21，1mmol/LIPTG诱导重组蛋白的表达。大量的蛋白以可溶的形式存在于胞浆中,重组蛋白的纯化用500g/LNi-NTA树脂，采用pH值从8.0至6.3的相同缓冲液(100mmol/LNaH2PO4,10mmol/LTris-HCl，8mol/LUrea)先洗涤未与树脂结合的杂质，再用pH值4.5缓冲液将结合在树脂上的重组蛋白洗涤出来。重组Sg蛋白全长氨基酸片段为第24-283位氨基酸。纯化的重组蛋白均在pH7.0标准磷酸盐缓冲液(PBS)中透析24h，恢复蛋白质的活性。1.3Western印迹分析重组Sg蛋白在10%-20%梯度凝胶(Bio-Rad)中电泳分离，或在4%-1

7、2%梯度NuPAGEBis-Tris胶(Invitrogen)中进行，并转移到Immobilon-P(Millipore)膜上，转移膜用酰胺黑染色或用含30g/L牛血清白蛋白的TBS缓冲液(50mmol/LTris，pH7.4，150mmol/LNaCl)在室温条件下封闭60min，冲洗后加入1∶2000稀释的一抗(兔抗人SgS20H或鼠抗人MHS-5)在常温下孵育膜1h，再用TBS缓冲液洗涤膜2次，加入碱性磷酸酶标记二抗(羊抗兔的IgG，1∶2000稀释)，室温下孵