大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施

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1、大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施作者：何俊，徐文莉，曾思，曾因明，庞庆丰【摘要】目的改良原代肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage,AM)培养技术，提高AM培养效果。方法SD大鼠，在体支气管灌洗肺获取AM，通过预先注射空气、14号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养AM。倒置显微镜连续观察AM的形态变化，台盼蓝拒染实验鉴定AM存活率，瑞氏-姬姆萨染色鉴定AM纯度。结果AM体外培养后40min即见细胞贴壁;2～3天时，细胞形态多样，呈圆形、不规则形、梭形等形态，胞体变大，胞质丰富。台盼蓝拒染

2、实验示AM存活率≥95%，瑞氏-姬姆萨染色示AM纯度≥95%。结论本实验改良了原代AM培养的技术方法，提高了原代AM培养效果。【关键词】肺泡巨噬细胞;细胞培养;技术改良Abstract:ObjectiveTomodifythetechniquesforprimarycultureofhighlypurifiedtheprimaryratalveolarmacrophages(AMs).MethodsAMswereisolatedinvivoandculturedwithsuchmodifiedtechniquesaspre-inject

3、ionofairandreclamationofbrochoalveolarlavagefluidwith14-buglesyringeneedle,low-speedcentrifugationandmulti-blowingbeforeplatingon-wellcultureplates.Themorphologicalchangeswereobservedundertheinvertedmicroscope.Thecellsurvivalratewasdetectedwithtrypanbluedyeexclusiontest,

4、andcellpuritywasdeterminedbyWright-Giemsastaining.ResultsInvitro,AMsadheredtoplasticsurfacewithin0min;-dayslater,cellmorphologypresentedmixedshapes,,circular,irregularandspindleshapes.Thetrypanbluetestshowedasurvivalrate≥95%oftheAMsandWright-Giemsastainingindicatedapurit

5、y≥95%oftheAMs.ConclusionThemodifiedtechniquesemployedinourexperimenthadbetterresultsfortheisolationandprimarycultureofAMs.Keywords:alveolarmacrophage;cellculture;techniquemodification肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage，AM)分布于呼吸道-肺泡表面，是肺部抗感染的第一道防线,是肺部抵抗病原感染的重要组成部分。AM不仅具有吞噬和抗原递呈功能，而

6、且还能分泌多种生物活性物质,对急性肺损伤的发生、发展及转归具有重要影响[1-3]，因此，AM一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型。但由于在分离培养原代AM过程中存在获取率低、混杂红细胞、容易污染损伤、不易贴壁等技术难题[4]，目前国内外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S[5]、大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383[6]等细胞株替代原代AM，然而AM细胞株与原代培养的AM在细胞形态、细胞活力及细胞生理等方面存在明显差异。因此，优化原代AM培养技术从而得到理想的AM对研究肺部感染性疾病发生机制有很重要的作用。本研究探讨AM培养技术的改良措

7、施及注意事项。　1材料和方法材料动物健康雄性SD大鼠，体重200～250g，由徐州医学院实验动物中心提供。主要试剂和器材DMEM(低糖)培养基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青有限公司)，青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)，台盼蓝染液(Sigma公司)，瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司)，细胞培养箱(美国ThermoFisherScientific)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本Motic公司)，离心机(美国Beckman公司)。1.方法AM的分离培养在

8、参考郭晓芳等[7-8]分离AM技术的基础上，我们对分离AM的方法加以改良。SD大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，引颈处死;在75%乙醇中浸泡消毒1～min，移到超净工作台上，仰卧于小手术台上，固定头尾;打