新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

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1、新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的探讨更为简单、有效的新生大鼠心肌细胞分离、培养方法。方法取出生24h内大鼠左心室，剪碎，0.125%胰蛋白酶、0.08%胶原酶Ⅰ分离，离心收集心肌细胞，差速贴壁法和化学试剂抑制非心肌细胞生长，纯化后培养于DMEM培养基。免疫荧光鉴定纯度，0.4%台盼蓝染色检查心肌细胞成活率。结果心肌细胞纯度为95%，平均成活率96%，并出现同簇细胞的同步跳动。结论本研究应用改良的新生大鼠心肌细胞培养方法，心肌细胞存活率高，纯度高，且操作简便，重复性好，是一种较为理想的心肌细胞原

2、代培养方法，可满足实验要求。【关键词】心肌细胞原代培养胶原酶ⅠAbstract:ObjectiveTofindaneasyyocardialcellsofratneonate.MethodsTheleftventricularmyocardiumovedfromneonateratsyocardialcellsyocardialcellseofadherence.Themyocardialcellsculturedicroscope,identifiedyocardialcellsand96percento

3、fthemyocardialcellsyocardialcellsforscientificexperimentation.Keyyocardialcell;primaryculture;collagenaseⅠ体外培养的心肌细胞具有自发节律性和收缩性特征，能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，可以从细胞、分子水平阐明一些基本理论，在心肌细胞生长发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要作用。因此，心肌细胞原代培养技术已广泛应用于心血管疾病机理及心血管药物和心脏组织工程学的研究

4、。自1960年Harary等［1］首次对EM培养基(Gibco公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，Ⅰ型胶原酶(Gibco公司)，Brdu(Sigma公司)，磷酸盐缓冲溶液(PBS)（Sigma公司），5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)（Sigma公司），0.4%台盼蓝(Sigma公司)，心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体(SantaCruz公司)，FITC标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物公司），明胶（Sigma公司）。1.2实验仪器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜、荧光倒置显微

5、镜、离心机、HH-42快速恒温数显水箱等。所有手术器械均高压灭菌。玻璃器皿用强酸浸泡过夜，流水冲洗20遍，去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干后高压灭菌备用。1.3心肌细胞的制备和培养新生24h内的SD大鼠10～15只，碘伏浸泡5min，固定四肢，75%的乙醇消毒皮肤，无菌眼科剪沿正中线入剪，再次用75%的乙醇消毒后沿胸骨正中入剪，注意避免剪破消化道以预防污染。无菌剪取心脏，仔细剥离心房及大血管组织，迅速置于预冷的不含Ca2+、Mg2+的PBS中，反复冲洗3遍，洗去残留的血细胞，将其剪成0.5mm×0.5

6、mm×0.5mm大小的组织块，放入锥形瓶中［3］，加入5倍体积的0.125%的胰蛋白酶和0.08%的胶原酶Ⅰ，37℃水浴，吸管吹打，消化5min后弃上清。重复消化3次，收集每次消化后的上清液，加适量(与上清液等体积)含10%新生牛血清的DMEM培养基，终止消化酶的作用。细胞悬液经200目孔径不锈钢网滤除未消化组织，上清液离心10min（850r/min），弃上清液，用含15%的新生牛血清、100万U青霉素、100万U链霉素、pH=7.15的DMEM培养基吹散沉淀细胞，接种于培养瓶中，CO2培养箱(37℃，5

7、%CO2，95%空气)中静置培养85min，将培养液转移(差速贴壁)至明胶处理过的24孔培养板，CO2培养箱中继续培养，隔天换培养液，前3天加入0.1mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。取培养72h的单层细胞进行实验。1.4心肌细胞质量评价1.4.1心肌细胞形态学观察光镜观察，常规倒置显微镜观察细胞形态。在倒置显微镜下观察培养液色泽变化；观察心肌细胞生长状态、形态变化；同时观察心肌细胞搏动的频率、节律、强度及范围，以判断心肌细胞培养是否成功和细胞生长是否良好。1.4.2台盼蓝拒染法计算细胞活力心肌细胞用

8、0.125%胰蛋白酶消化，充分吹打，制成单细胞悬液，稀释成2×108个/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加等量0.4%台盼蓝溶液，混匀后用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。镜下观察，死细胞染成蓝色，而活细胞拒染。细胞存活率＝活细胞数/总细胞(活细胞+死细胞)数×100%1.4.3心肌细胞纯度鉴定心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)免疫荧光鉴定计算心肌细胞比例：心肌细胞培养4天后弃培养液，4%多聚甲醛固定10～20min