第七章 常用分子生物学技术的原理及应用（二）ppt课件

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1、第七章常用分子生物学技术的原理及应用（二）Thepopulartechnologyinmolecularbiology:principleandapplicationMolecularCloningVectorsplasmidphagecDNAgenomiclibrariescDNAlibrariesDNAligationRecombinantDNAmoleculesTransformationSelectionchromosomewalkingmolecularhybridizationDNAsequencingThepolymeras

2、echainreaction(PCR)inversePCRreversetranscriptasePCRQuantitativePCRasymmetricPCRRNAiMultiplexPCRSouthernBlottingDNAfingerprintingWesternblottingNorthernblottingArbitraryprimerPCRfluorescenceinsituhybridization(FISH)GenechiporDNAchip上一章常用技术词汇四核酸序列分析Nucleicacidsequenceanalys

3、is核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)---略DNA链的末端合成终止法(Sanger法)(Sanger双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′双脱氧核苷三磷酸脱去二、DNA链末端合成终止法Sanger1958年和1980年两次获Nobel奖三、DNA自动测序用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上

4、的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。ABIPRISM310型DNA测序仪主要用于DNA序列分析(包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等PE3700型DNA测序仪DNA自动测序结果举例五、生物大分子相互作用研究技术TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能

5、量转换效应分析噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与B

6、D基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1

7、X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果图染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图六、遗传修饰动物模型的建立及应用Theestablishmentandapplicationofheredity-modifiedanimalmodel转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发

8、育成个体。转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术核转移技术即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的卵细