实验一_质粒dna的提取及检测课件

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1、实验一质粒DNA的提取及检测质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19质粒提取的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA第一部分　质粒DNA的提取一．目的了解提取质粒的原理。学

2、习和掌握质粒提取的方法和技术。细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化二．原理碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DN

3、A（可省略）。☆原理示意图返回目录返回原理三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、（三）试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I溶液II溶液IIITE(pH8.0)溶液I50mmol/L葡萄糖/1mg/mL溶菌酶25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释

4、)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNATE(pH8.0)10mmol/LTris·Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)RNA酶（降解RNA）作用：稳定ＤＮＡ特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提）质粒提取试剂盒常用方法：小量碱裂解法满足不同需要的试剂盒

5、纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒kit大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验四、实验步骤接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5ml菌液入1.5ml的离心管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积

6、到一新管上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）12000rpm，离心10min晾干沉淀沉淀用20ulTE溶解沉淀法吸附管用BL500ul平衡取上清加入吸附管5000rpm离心5min加PW漂洗液500ul，放置2min10000rpm离心5min，晾干加30ulTE，10000rpm离心5min（收集到干净的EP管中）吸附法第二部分　琼脂糖凝

7、胶电泳相关知识电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA

8、（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。影响迁移率的