质粒DNA的提取及检测课件.ppt

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1、质粒DNA的提取及检测相关知识基因工程又称DNA重组技术外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞常用到的工具酶限制性内切酶连接酶聚合酶逆转录酶激酶和磷酸酶核酸外切酶和核酸内切酶DNA酶和RNA酶甲基化酶拓扑异构酶载体质粒载体：pUC19、pET21a噬菌体载体：λ噬菌体载体M13噬菌体载体病毒：pCAT3人工染色体：酵母人工染色体特点：自我复制、筛选标记具有

2、合适的限制酶切位点高拷贝数、小分子量、高稳定性克隆载体：有复制起点表达载体：有目的基因　　　　　　的启动子（真核生物、原核生物）质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19(500~700提纯的思路质粒的特性：共价、闭合

3、、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第一部分　质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。二、实验原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状

4、这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、LB液体培养基（三）试剂：溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有

5、机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA四、实验步骤接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体加入150uL溶

6、液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用20uLRTE溶

7、解，-200C保存第二部分　琼脂糖凝胶电泳相关知识电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度0.3　0.6　0.7　0

8、.9　1.2　1.5　2.0线状DNA大小/kb5-60　1-20　0.8-10　0.5-7　0.4-6　0.2-4　0.1-3核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LD