急性经皮毒性实验及全血胆碱ppt课件

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1、i＝(㏒LD100-㏒LD0)/(n－1)i:组距（相邻两个剂量组对数剂量之差）n：设计的剂量组数Sm＝i√∑pq/nlgLD50及其95％可信限＝lgLD50±1.96xSm雄鼠1.628±1.96x0.015＝1.628±0.029442.5（39.7－47.1）mg/kg急性经皮毒性实验及全血胆碱酯酶活性的测定实验的目的和意义掌握胆碱酯酶活性测定的方法＆原理了解受试物引起局部皮肤损伤、全身中毒等毒性效应了解甲胺磷经皮染毒后对全血胆碱酯酶的影响为进一步的实验提供参考依据急性经皮毒性试验定性：浸尾试验定量：一、动物的选择成年健康大鼠180－220g

2、动物数6－10只二、剂量通过预实验确定最高剂量组氯甲胺磷经皮对大鼠LD50：＞2000mg/kg(经皮)三、受试物的配制：本次为200mg/kg，浓度为20mg/ml给药容积：0.1ml/100g采血时间：0min，30min，60min,2h,4,全血胆碱酯酶的测定胆碱酯酶测定的意义1、作为有机磷农药中毒防治的试验指南2、为亚慢性、慢性的域剂量提供参考指标3、解毒药的筛选原理：AchE在PH为7.4的PBS环境中可以分解ASCH(硫代乙酰胆碱)为硫代胆碱和乙酸，前者进而与DTNB(5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸)反应生成黄色产物TNB（5-巯基-

3、2-硝基苯甲酸），通过分光光度计，在412nm波长下比色定量，得出OD值，通过标准曲线反推AchE的活性。硫代乙酰胆碱（ASCH）胆碱酯酶（AchE）硫代胆碱＋乙酸+DTNB黄色的TNB（5-巯基-2-硝基苯甲酸）实验步骤:1、取14只试管，分两组（样品组、对照组），样品组每管加PBS3.0ml2、动物染毒，尾尖采血（20ul)，症状观察＆记录3、将不同时间点采集的血样加入（样品组）试管中，冰浴（立即放进冰箱）1234567（第二天）采血时间015’30’1h2h5h22h4、将样品组各管混匀，分别取1.5ml到对应的对照管中，对照组各管加1-2滴毒

4、扁豆碱，充分混匀5、14管中各加入0.5mlDTNB混匀（37°水浴5min)6、加入0.5ml的Asch充分混匀并计时7、37℃水浴，标准温浴10min，每2-3min振荡摇动一次，测定组管中加1-2滴毒扁豆碱，充分混匀中止反应8、14管1500转/min离心10min，取上清，412nm比色，以自身对照调零，测A组＆B组的吸光度，记录OD的值。9、查标准曲线，计算AChE活性，作图（活性-时间）标准曲线的制作：以GSH替代Asch，经反应后以分光光度计测量OD的值，以GSH的量为横坐标，OD的值为纵坐标，绘制标准曲线OD值GSH的量(umol)1

5、0、标准管配置管号12345巯基标准00.050.100.150.20H2O(ml)0.50.450.400.350.30PBS(ml)1.51.51.51.51.5DTNB溶液(ml)0.50.50.50.50.5OD值1umol谷胱甘肽能提供1umol巯基，其显色效应相当于1umol的硫代胆碱，也相当于酶促使1umol基质（乙酰硫代胆碱）的效应。AchE活力（umolAich/ml/min）＝标准曲线查得的umol/分析血样量（ml）×反应时间（min）酶活力单位：1ml血样在37℃条件下每分钟水解1umol乙酰硫代胆碱产生1umol巯基为一个酶

6、活力单位实验结果：1、急性经皮毒性试验2、全血胆碱酯酶活性得测定：用分光光度计412nm测定对照管＆测定管的OD值编号1234567OD值标曲上得到的umolAchE活力（umolATcH/ml/min）作图（活性-时间曲线）以反应时间为横坐标，以AchE活力为纵坐标，画一条曲线此曲线反映了动物染毒后，其胆碱酯酶随时间的变化。结果分析1、甲胺磷的经皮毒性作用2、全血胆碱酯酶的改变