人骨肉瘤差异表达基因的筛选

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1、人骨肉瘤差异表达基因的筛选摘要:目的研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因，探讨骨肉瘤的基因改变，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础.方法采用mRNA差异展示技术，应用3条锚定引物和8条随机引物从人骨肉瘤组织与正常骨组织中分离出差异表达基因，对其进行克隆、测序，用打点杂交技术证实其是否为差异表达基因，将筛选出的差异表达基因在GenBank检索进行序列同源性分析.结果筛选及克隆出6条差异条带，为ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12，RNA打点杂交证实它们在骨肉瘤中表达，在正常骨组织中不表

2、达.6条差异片段经序列测定，在GenBank数据库中进行序列相似性分析，证实ZOL03，ZOL51同源性极低;1C82，1C74，2A21，2G12同源性较低，此6条片段为新基因序列，ORFfinder分析未发现具有开放读框，均属于非编码区序列.其中ZOL03和ZOL51两个序列在GenBank数据库中登录，接受号为BI894276和BI936370.结论分离并克隆了人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的6条差异表达基因，同源性差，均确认为新基因，可能是骨肉瘤差异表达相关基因.　　Keyanosteosaratissueand

3、normalbonetissueandtodiscussthealterationofgenesinosteosara.METHODSByRNAdifferentialdisplayPCR，us-ing3anchorprimersand8stochasticprimers，differentiallyexpressedgenesbetanosteosaratissueandnor-malbonetissuealbonetissue.SequencingandsearchinginGenBankforparability

4、foundthatthe6sequencesilartosequencesinGenBank.6sequencesbersanosteosaraandnormalbonetissuesanosteosara.　　0引言　　骨肉瘤是骨科最常见的高度恶性肿瘤.只有找到骨肉瘤特异性基因（差异表达基因）才有可能建立高度敏感且准确的基因诊断方法.因此，能否找到与骨肉瘤发生发展密切相关的差异表达基因已成为制约研究骨肉瘤治疗及早期诊断的关键因素.我们采用差异展示PCR（DD-PCR）技术研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因

5、，探讨骨肉瘤的基因改变，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础.　　1材料和方法　　1.1材料唐都医院全军骨肿瘤研究所确诊、未经任何治疗且无法保肢的骨肉瘤患者之截肢标本，选取骨肉瘤组织及相同肢体的正常骨组织.差示PCR引物采用GenHunter公司Liang和Pardee1996-04提供的第三代序列，由上海生物工程公司合成，5′端引物为8条，3′端引物为3条，其序列为:H-AP1:5′-AAGCTTGATTGCC-3′;H-AP　2:5′-AAGCTTCGACTGT-3′;H-AP　3:5′-AAGCTTT-GCTCAG

6、-3′;H-AP　4:5′-AAGCTTCTCAACG-3′;H-AP　5:5′-AAGCTTAGTAGGC-3′;H-AP　6:5′-AAGCTTGCACCAT-3′;H-AP　7:5′-AAGCTTAA-CGAGG-3′;H-AP　8:5′-AAGCTTTTACCGC-3′;H-T　11G:5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′;H-T　11A:5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′;H-T　11C:5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′.JM109为本所保存，pGEM○R-T载体购自Promeg

7、a公司.无RNA的DNA酶Ⅰ，SalⅠ和SphⅠ购自TaKaLa公司;Su-perscriptTMⅡRNaseH-反转录酶及DNA凝胶回收试剂盒购自Gibco公司;α-32PdATP及г-32PdATP购自北京亚辉生物工程公司.　　1.2方法取新鲜截肢标本，无菌条件下，即取截肢体正常骨段骨组织，剔除骨膜，除净松质骨和骨髓，将此皮质骨咬至0.5cm×0.5cm大小，以4℃生理盐水反复冲洗后，迅速置液氮中保存.将保存的骨组织取出置室温下3～5min，再放回液氮中，反复冻融5～8次.取此冻融骨组织约200mg浸入装有2mL预

8、冷变性液的离心管中，冰浴下以高速离散器快速粉碎、匀浆，以备提取总RNA［2］.参照奥斯伯标准酚/氯仿法抽提正常骨组织和骨肉瘤组织匀浆液中总RNA［1］，用无RNA的DNA酶Ⅰ处理后以DEPC处理水溶解，紫外分光光度仪测定总RNA吸光度（A260nm，A280nm），变性琼脂糖凝胶电泳观察总RNA完整性.mRNA差异显示按GenHu