差异表达基因的几种筛选方法论文

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1、差异表达基因的几种筛选方法论文【关键词】mRNA差异显示；基因表达；DNA微阵列【摘要】多种因素导致的基因差异性表达与疾病的发生发展密切有关，分离差异表达基因，对于研究细胞生命过程的调节机制及致病机制具有重要意义.20世纪90年代以来，先后出现了mRNA差异显示PCR（mRNADDRTPCR）、代表性差异分析（RDA）、抑制性消减杂交（SSH）、基因表达连续性分析（SAGE）和DNA微阵列（DNAmicroarray）等多种分析差别表达基因的方法.我们对以上方法的原理、基本步骤及其应用进行简要综述.【关键词】mR

2、NA差异显示；基因表达；DNA微阵列0引言随着各类基因组计划的相继完成，人类面临的更艰巨的任务是研究基因功能活动，也就是说基因组序列分析仅仅代表了遗传信息复杂性的一个层次，而遗传信息有序地、时相地表达则是决定生物体及其行为的另一个层次.所以，发现不同生物体及其组织在各种状态下（正常状态、发育、衰老、损伤及疾病）差异表达的基因具有十分重要的意义.freelRNA的丰度高低及有无进行比较.差异表达基因有两个含义，即表达基因的种类变化和基因表达量的变化.传统的基因分析方法如Northern杂交、斑点杂交等存在费时、费力

3、的缺点，已不适宜进行大规模基因表达分析研究的需要.因此随着分子生物学的发展，出现了大量新方法，按其技术特点可分为三类：①以杂交为基础的技术，包括Northernblotting，Slmapping/Rnase保护、抑制性消减杂交和DNA微阵列；②以PCR为基础的技术，如差异显示PCR（DDPCR）、代表性差异分析（RDA）；③以测序为基础的技术，如表达序列标签（EST）、基因表达连续性分析（SAGE）等.我们对目前主要的差异表达基因的筛选方法作一综述.1mRNA差异显示PCR(differentialdispla

4、yPCR，DDPCR)mRNA差异显示PCR又称为差别显示反转录PCR（differentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRTPCR）.DDRTPCR技术［1-3］最早于1992年出现，可以用于分离在不同的真核细胞中差异表达的cDNA并加以克隆.其原理是将两种细胞的mRNA逆转录后进行PCR扩增.PCR3′端引物序列是针对mRNA的poly(A)尾设计的，一般是11个T再加上两个碱基，这样12种3′端引物(T11AA，T11AC,T11AG，T11AT，T11CA，T11G

5、A，T11CC，T11CG，T11CT，T11GC，T11GG，TT11GT)就可以与所有mRNA的poly(A)尾匹配；5′端引物是随机引物，一般为10个碱基，因此产生一些不同长度的cDNA片段，电泳后比较两者的差别而得到差异表达基因的cDNA.但这个方法存在许多严重的缺陷，它的5′端随机引物一般常有2～3个碱基不能与cDNA模板完全匹配，而且PCR反应中随机性、偶然性比较大，容易形成非特异性扩增而造成高的假阳性率，这就使下游的筛选工作很巨大.理论上此方法可以检测到95％以上的转录体，但由于引物序列的随机性和竞

6、争性模板结合位点的存在，很难确定实际的原始RNA丰度.尽管有上述缺陷，但由于其实验步骤较简单，此方法在实际工作中应用仍较多，例如用于筛选在肿瘤发生、愈伤过程以及胚胎植入过程中起重要作用的基因等.2代表性差异分析(representationaldifferenceanalysis，RDA)RDA［4-8］是Lisitsyn等于l993年在差减杂交的技术基础上发展的分析基因组DNA差异的方法，Hubank等于l994年对其作改良后用于cDNA的分析.该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法［9］,主要步骤包

7、括:①将对照组（driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA片段群，接上接头进行第1次PCR扩增；②将testercDNA和drivercDNA用限制性内切酶酶切，形成平均长度256bp的cDNA；③将接头消化,在testercDNA末端接上新的接头，testercDNA和drivercDNA按1∶100比例混合.过量的divercDNA可与testercDNA中互补的部分形成双链；④复性，以新接头为引物进行第2轮PCR.三种杂合体中只有自身退火形成的tester/tester杂合体才能和引物配

8、对,并以指数形式扩增；tester/driver杂合体只能是线性递增；而driver/driver杂合体则无法扩增.该方法的主要优点就是能够使差异表达的基因高度富集，重复性较好，假阳性少.利用RDA人们已经发现了多个新基因.如白血病凋亡相关基因TFAR19，人乳腺癌相关基因TSPS0等.Arava等［10］利用RDA分析了胰腺β细胞和α细胞，发现26个基因在β细胞中高表达