人β┐防御素┐3基因的克隆和序列测定

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1、人β┐防御素┐3基因的克隆和序列测定　　Keyerasechainreaction　　Abstract:AIMToclonethegeneencodinghumanβ-de-fensin-3.METHODSTotalRNAhu-manforeskintissueandplementaryDNAadebyreversetranscriptionastemplateforpolymerasechainreac-tion.PCRproductofexpectedsizeedtoidentifytheclonecon-taining

2、theDNAfragmentofinterest，folloentthatisidenticaltothehBD-3cDNAsequenceregisteredinGenBank.CONCLUSIONhBD-3geneissuc-cessfullyclonedfromhumanforeskintissue.　　0引言　　为适应生存的外部环境，自然界中的每种生物都发展出了一套有效的防范机制.近年来从许多生物物种的体内都相继发现了一系列内源性的抗微生物短肽（antimicrobialpeptide），如Cecropin样抗菌肽、

3、富含Pro残基的抗菌肽、含Gly残基的抗菌肽、富含Cys残基的抗菌肽以及杀菌通透性增加蛋白［1-3］，其中富含Cys残基的碱性抗菌肽被命名为防御素（de-fensin）［4］.这些短肽分子中含有3～4对二硫键，具有独特的稳态结构和广泛的生物学活性，尤其是对细菌等病原微生物广谱的杀伤作用，而备受人们关注.已知的防御素依其结构特征和不同，分为四种类型，即α-防御素、β-防御素、昆虫防御素和植物防御素.研究表明，上皮细胞是防御素的一个主要.近年发现的β-防御素-1和2（humanβ-defensin1，2，hBD-1，2）在上皮细

4、胞中有着广泛的分布，是机体重要的内源性生物防御素屏障［5，6］.根据最新研究报道，德国学者Harder等［7］又从人牛皮癣的皮肤组织中纯化到β-防御素家族的新成员hBD-3.该蛋白对革兰氏阳性菌具有高效而广谱的杀伤作用.　　1材料和方法　　1.1人皮肤总RNA的提取及cDNA的合成临床获取正常人新鲜包皮组织约150mg，用TRIzol试剂（GibcoBRL）提取总RNA，操作按使用说明进行.取2μg总RNA进行反转录（OmniscriptRTkit，Qi-agen）.反应条件为:60℃2min;30℃30min;80℃2mi

5、n.　　1.2PCR反应根据GenBank报道的hBD-3的cDNA序列设计一对引物，以反转录产物为模板，采用TaqplusDNA聚合酶（Sangon）进行PCR反应.引物由赛百盛公司合成，其序列为:5’CGGGATCCTGGGTCTCAGCG;3’GGAATTCCACTCTCG-TCATG.引物5’端加上BamHI酶切位点，并设计CG两个保护碱基，3’端加上EcoRI酶切位点，并设计一个G作为保护碱基.在200μLPCR专用薄壁管（Promega）中依次加入10×PCR缓冲液5μL，dNTPs10pmol，引物各25pmo

6、l，cDNA2μL，TaqplusDNApolymerase（Sangon）5u，去离子水补充反应体积至50μL.按以下程序进行PCR反应:94℃5min;94℃20s，51℃20s，72℃20s，35循环;72℃30min.产物在20gL-1琼脂糖凝胶上电泳.　　1.3PCR产物回收从胶上切下含目的片段的电泳条带，用AdvantagePCR-PureKit（Clontech）回收，操作按使用说明书进行，回收体积为20μL.　　1.4连接反应取PCR产物3μL，pGEM-T-EASY载体（Promega）1μL，2×Buff

7、er5μL，DNA连接酶1μL，在1.5mL微量离心管中混匀，16℃过夜.　　1.5重组质粒转化DH┐5α感受态宿主菌采用CaCl2法常规制备DH-5α感受态宿主菌［8］，与连接产物在冰水中共浴30min，42℃水浴中休克90s，加入不含氨苄的LB培养基800μL，置37℃45min，离心弃上清，留约100μL残液，加入IPTG和X-gal各15μL，混匀并使菌体重悬，均匀涂布于含氨苄青霉素（100mgL-1）的LB平板上，37℃过夜.　　1.6重组质粒的筛选及鉴定从平板中随机挑选数个白色克隆，接种于3mL含氨苄青霉素（10

8、0mgL-1）的LB液体培养基中，固定在37℃摇床上，200rmin-1震荡培养过夜.取1.5mL菌液离心收集菌体，采用华舜小量质粒抽提试剂盒提取质粒，用EcoRI单酶切及PCR鉴定.酶切条件为:质粒8.5μL，10×Buffer1μL，EcoRI（GibcoBRL）2u，37℃，2h.P