鼠肠系膜动脉平滑肌细胞bkca通道组成亚基的增龄性变化特征

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1、鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道组成亚基的增龄性变化特征　　血管的形态和功能亦随年龄的增长发生各种退行性变化,主要表现为管壁增厚、血管增生导致管腔变窄、弹性纤维减少、内皮细胞功能紊乱、血管硬度增加等。在血管老化进程中,血管平滑肌上的各种离子通道也将发生增龄性变化。其中,大电导钙激活钾通道(large-conductancecalcium-activatedK+channels,BKCa)在血管平滑肌细胞的膜电位及血管张力维持中起着重要的负反馈调节作用,因此它在衰老及疾病中的变化也受到广泛关注。

2、血管平滑肌细胞上的BKCa通道由α亚基和β1亚基构成。其中4个α亚基构成孔道结构,而β1亚基则是重要的功能调控单位。前期研究中我们发现,衰老可导致大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道活性下降,表现为电压敏感性和钙敏感性下降、开放时间缩短而关闭时间延长。然而,大鼠肠系膜动脉BKCa通道α和β1亚基的分子表达随年龄增长究竟发生怎样的变化尚未见文献报道。因此,本研究拟选用青年、中年和老年大鼠,探讨其肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道组成亚

3、基的增龄性变化特征,以期为衰老导致的外周阻力动脉的舒缩功能改变寻找分子依据。　　1、材料与方法　　1.1实验动物与分组　　2月龄健康雄性B1)购自AlomoneLabs(以色列);辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自ProteintechGroup(美国);β-actin(R-22):sc-130657购自SantaCruz(美国);去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、BKCa通道选择性阻断剂Iberiotoxin(IbTX)、Hepes、EDTA均购自Sigma(美国)

4、;NaCl、KCl、MgCl2、Glucose、NaHCO3等购自北京化学试剂公司;肝素钠购于北京东胜泰博科技有限公司。Krebs液成分:131.5mmol/LNaCl,5mmol/LKCl,1.2mmol/LNaH2PO4,1.2mmol/LMgCl2,2.5mmol/LCaCl2,11.2mmol/LGlucose,13.5mmol/LNaHCO3,0.025mmol/LEDTA,持续充氧(95%O2~5%CO2),pH=7.4。　　1.3大鼠心血管反应性测定　　青年组、中年组和老年组各选取

5、6只,进行股动、静脉插管手术。术后24h,动物恢复良好,自由饮水进食,在清醒状态下进行基础血压测试。　　1.4离体血管环制备及张力测定　　另选取每组各6只大鼠进行肠系膜动脉血管环张力测定和免疫组织化学实验(见下文)。大鼠腹腔麻醉后断头处死,迅速打开腹腔取肠系膜动脉,在4℃Krebs液中剔除血管壁周围脂肪和血管分支并用平头针来回穿插去除内皮,制成长4mm血管环,进行血管收缩张力测定。先用120mmol/LKCl刺激血管收缩,以净收缩幅度作为100%最大收缩,并用乙酰胆碱(Ach)检测内皮完整性。之

6、后分别再给予去甲肾上腺素(10-9~10-5mol/L)和IbTX(10-7mol/L)刺激血管环,观察各组血管张力及反应性的变化。　　1.5蛋白免疫印迹分析　　每组选取6只大鼠进行肠系膜动脉BKCa通道α和β1亚基蛋白免疫印迹分析。大鼠麻醉断头,分离出肠系膜动脉并除去脂肪,立即投入液氮中暂存,之后转入-80℃冰箱保存。称取100mg组织,迅速加入500μLRIPA裂解液,用匀浆器在冰水浴中匀浆10次,每次匀4~5s,间隔4~5s。将匀浆液于4℃以13000g离心30

7、min,取上清液待测。按照常规操作进行蛋白浓度的测定、电泳样品制备、聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(上样量每孔40~50μg蛋白)、转膜(BKCaα亚基300mA恒流1.5h;BKCaβ1亚基250mA恒流50min)、5%BSA封闭2h。加入用0.01mol/LTBST稀释的一抗[anti-KCa1.1(BKCa),1∶300;anti-sloβ1(KMB1),1∶200;β-actin(R-22)∶sc-130657,1∶300],室温

8、脱色摇床上摇动孵育1h,4℃孵育过夜;0.01mol/LTBST漂洗三次,加入用辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG[1∶16000(BKCaα亚基);1∶2000(BKCaβ1亚基);1∶4000(β-actin)]孵育1h。免疫蛋白活性由增强化学发光法检测,并采用QuantityOne软件进行半定量分析。　　1.6统计学分析　　所有结果均以x±s表示,应用SPSS17.0、GraphPadPrism5进行数据统计分析,青年组、中年组和老年组之间比较采用