质粒dna微量制备

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1、实验二十一、质粒DNA的微量制备 实验目的 (1)了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用(2)掌握质粒DNA分离、纯化的原理(3)学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法 实验原理 质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生型的自主复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因

2、工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛的用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。遗传工程使用的质粒一般来自细菌，现在发现不仅原核生物，而且真核生物如酵母、天蓝色链霉菌等也存在质粒。在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2％左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内复制，一般分为两种类型：

3、严密控制复制型和松弛控制复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞中只含一个或几个质粒分子，通常大的质粒如F因子等拷贝数少，复制受到严格控制。松弛控制型复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如ColE1质粒及其衍生质粒，在每个细胞内约含有20多个拷贝。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素，已达到阻止染色体DNA合成而使细胞内没有蛋白质合成的情况下，由于有关复制所需

4、要的蛋白质的缺少，染色体与严密型质粒的复制都随之停止，但松弛型质粒不受细菌这些复制蛋白的影响，如ColE1质粒或他的衍生质粒仍然继续复制12－16h，直到每个细胞中大约积累1000－2000个拷贝为止。此时质粒DNA含量甚至可达到细胞DNA总量的40－50％。性因子（F因子）、抗药因子（R因子）和大肠杆菌素因子等都是常见的质粒。对于带有抗药基因的ColE1衍生质粒，不仅能够大量制备，又便于检出。所以，这种质粒被广泛的使用。质粒pBR322就是ColE1的衍生质粒，它带有抗氨苄青霉素和抗四环素的基因，根据该质粒的抗

5、药性，较容易检出和鉴定。以pBR322为基础，人工构建的pBR322系列质粒以及pUC系列质粒等都是遗传工程中常用的基因运载体。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤大同小异，本实验着重介绍两种常用的、快速、微量方法。1.碱裂解法在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时

6、易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。2.煮沸法细胞经溶菌酶破壁后，用含有TritonX－100的缓冲液处理，溶解细胞膜。在高温条件下，使蛋白质变性。变性蛋白带着染色体DNA一

7、起沉淀下来，质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理，沉淀出质粒DNA。以上两种制备方法的实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核算降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。在嵌合燃料存在的情况下，进行氯化铯密度梯度离心，线状的染色体DNA由于插入较多的染料分子而变的比重较轻，共价闭环质粒DNA插入的染料分子较少，比重较大，从而可以获得高纯度的质粒

8、DNA。在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在于细胞质内，这种DNA分子叫作共价闭环DNA，在一些条件下，如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，则另一条链就能自由旋转而使分子内的扭曲消除，形成松弛型的分子叫做开环DNA分子，本实验制备出的质粒为cccDNA，但由于较长时间的贮存或操作等原因，会形成部分ocDNA。本实验制得的质粒DNA经鉴定后可直接用于限制性内切酶降解、细菌转