分子生物学实验

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1、实验一RNA的制备及其鉴定一、实验原理细胞内的RNA通常与蛋白结合，以核蛋白的的形式存在。分离、制备RNA时，首先必须破碎细胞，是核蛋0释放到溶液中并与蛋0质分离，然后将RNA同其它的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。由于RNase能迅速降解RNA,且耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子，用蛋白质变性剂只能使之暂时失活，变性剂去除后，其活性油可以恢复。因此，分离提取RNA时，为确保RNA的完整性，必须创造一个无RNase的环境，同时加上含RNase抑制剂的试剂，Trizol。评价RNA质景的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于存效的去除

2、RNA提取物中的DNA、蛋白质和其它杂质；完整的RNA则取决于最大限度地避免提纯化过程中的内源性及外源性RNase对RNA的降解。通常采用紫外分光光度计法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0,但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.7〜2.0之间，低于该值表明有蛋白污染，需要进一步用酚/氯仿抽提。RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28s和18srRNA经过goldview染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2:1.二、结果与谈论图为纯化后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳后的显色图片，第5道

3、为我们组的RNA电泳后的结果。如图显示，RNA只在5sRNA处有带，而18s和28s处都没有出现带，说明我们组的RNA全部都分解为小分子量的5sRNAoOD260=1.504；OD280=1.128；OD260/280=1.33正常的较均一的RNA比值为1.8到2.0。我们值比1.8要小，说明我们的样品中蛋白质含量偏高。探讨具体的实验失败原因，加入氯仿吸取上清时，由于操作不熟练，可能吸入了中间蛋0质层部分液体，导致样品中蛋0含量偏高。由于异丙醇能较好的溶解5sRNA,我们的琼脂糖电泳显示5sRNA较多,所以我们的大分子量的RNA可能在其后面步骤被

4、分解，其中可能性最大的是在干燥环节。首先因为在这个步骤，没有RNA酶抑制剂的保护，再者我们在干燥时反复摆弄离心管，极可能照成污染。实验二反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术一、实验原理将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR经行大量扩增，人们将这种偶联称为反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）cRT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。二、实验步骤（略）三、实验结果和讨论MakercDNA阳性标准cDNA阳性标准CDNA2这张图为我们组PCR后通过琼脂糖凝胶电泳的结果。其中第二

5、条和第三条为我们组从上午提纯后的RNA反转荥成的cDNA后PCR扩增产物。第三条和第四条为老师给的阳性参考。结果说明，我们的PCR后没有目的条带，没有合成我们想要的核酸链。由于实验二的纯化后的RNA没存我们需要的长链，用实验二的RNA不能反转录成我们需要的cDNA,结果PCR产物必然不会出现像老师给的阳性参考一样的条带。